2-酮-L-古龙酸还原酶分离纯化及其理化、酶学性质的研究

从发酵Ｌ山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ和Ｂａｃｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ２９８０混和菌株的无细胞抽提液中分离到了２酮Ｌ古龙酸还原酶（ＫＧＲ），测得其分子量为９０ｋＤａ。动力学性质研究表明它为一个典型的ＭｉｃｈａｅｌｉｓＭｅｎｔｅｎ氏酶，对２酮Ｌ古龙酸作用的Ｋｍ值为３４２×１０－３ｍｏｌ，最适作用ｐＨ为６５，最适作用温度为３０℃。２酮Ｌ古龙酸还原酶的合成不受Ｌ山梨糖和２酮Ｌ古龙酸的诱导，故推测２酮Ｌ古龙酸还原酶是Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ的一个组成酶。

酮古龙酸菌Y25 D-2-羟酸脱氢酶的表达、纯化与酶学性质

目的克隆酮古龙酸菌D-2-羟酸脱氢酶(2-hydroxyacid dehydrogenase,HADH)基因hadh,并在大肠杆菌中进行表达、纯化和酶学性质检测。方法 PCR扩增酮古龙酸菌D-2-羟酸脱氢酶基因hadh,构建表达载体pTIGhadh,转化大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌进行诱导表达,表达产物经Ni+亲和层析柱进行纯化后进行酶学性质检测。结果 SDS-PAGE分析结果显示,重组菌中HADH表达量可达菌体总蛋白的50%以上,相对分子质量约35×103。酶学性质检测结果表明,纯化的HADH以2-酮基古龙酸(2-keto-gulonic acid,2-KGA)为底物,最适pH 8.0,最适温度45℃,几种常见金属离子和螯合剂对HADH的活性影响微弱或无影响,以2-KGA为底物时的HADH最大反应速度27 U/mg,Km值为2.6 mmol/L,体内酶活检测结果表明,HADH能够代谢2-KGA。结论重组HADH在大肠杆菌中获得了高效表达,并研究了其酶学性质,为后续山梨糖代谢通路研究和进一步提高糖酸转化率奠定了基础。