麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红素酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4.0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC31671中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4.0kb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4.0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4.0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因定位于BssHⅡ-BamHⅠ1.3kb DNA片段上。对1.3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明:此1.3kb DNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77.4％,相同性为66.7％,对麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。

发酵液中酮基还原酶活性测定方法的构建

本研究以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为底物,还原型辅酶Ⅱ(NADPH)为辅酶,应用紫外-可见光分光光度计法测定发酵液中酮基还原酶活性,通过连续测定NADPH消耗量来计算酶活力,得到了最佳反应体系:NADPH浓度为0.2 mmol/L,COBE浓度为1.0 mmol/L,磷酸缓冲溶液浓度为100 mmol/L、p H值为6,反应温度为40℃。在此条件下平行检测5次酶活,相对标准偏差(RSD)为0.48%。此方法操作简便,耗时短,精确度高,重复性好,可作为发酵液中酮基还原酶活性测定方法加以推广。

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR法扩增麦迪霉素产生菌酮基还原酶（MKR）基因，得到约0．8kb的DNA片段，扩增片段重组到利用依赖T7RNA聚合酶的高效表达载体pT7－7中，在大肠杆菌中表达出28．9kD的蛋白质。表达的蛋白质具有生物活性。

酮基还原酶在Pichia pastoris中表达策略

［目的］报道酮基还原酶在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中的表达，探讨提高酮基还原酶表达量的策略．［方 法］用不同浓度的 Ｇ４１８甲醇、不同的 ｐＨ值、不同的诱导时间来考察对酮基还原酶表达水平的影响．［结 果］当 Ｇ４１８的浓度提高到 ３ ｇ／Ｌ，控制培养基的 ｐＨ在 ６～７之间，以甲醇与甘油之比为 １：１诱导 ４８ｈ时 酮基还原酶的表达水平最高，可达３０％

均匀设计法优化重组大肠杆菌产酮基还原酶培养基

系统研究了典型碳源、氮源、金属离子、磷酸盐以及初始p H值等因素对重组大肠杆菌产酮基还原酶的影响。单因素试验结果表明,甘油、酵母浸粉FM888、酵母蛋白胨FP101、Mg SO4·7H2O以及离子浓度为0.1 mol·L-1 p H值为T7的磷酸缓冲液对菌体生长以及酶活的表达有一定的促进作用。通过均匀设计试验及分析得到培养基的最优配方:甘油6.86 g·L-1,FM888 19.53g·L-1,FP101 8.37 g·L-1,Mg SO4·7H2O 2.50 g·L-1,K2HPO414.96 g·L-1,KH2PO47.34 g·L-1。优化条件下酶活为431.21 U·m L-1,比优化前(70.25 U·m L-1)提高了5.13倍。此研究可为工业化大生产提供理论指导。

产酮基还原酶基因工程菌培养温度和转速条件的优化

考察了27℃、30℃、33℃、37℃条件下酮基还原酶基因工程菌生长与产酶的影响。结果发现,37℃以下随着温度的升高,菌体产酶活性得到提升和提前,37℃条件下10 h最大酶活达到了157.5 U/m L。但是所有温度条件下的发酵后期,酶活都出现了下降,发酵后期转速的下降可能是一个原因。因此对37℃下不同恒定转速200 r/min、300 r/min、400 r/min、480 r/min的发酵条件进行了实验。结果发现,转速的恒定对于菌体酶活的积累具有重要意义,恒定转速480 r/min条件下酶活逐渐升高,20 h的酶活为217.1 U/m L。此研究确定了酮基还原酶基因工程菌发酵产酶的最佳温度和转速,并对酮基还原酶进一步的补料分批发酵优化具有指导意义。

酮基还原酶基因工程菌发酵特性的研究

主要研究了基因工程大肠杆菌发酵生产酮基还原酶的发酵特性。结果表明，发酵12h菌体浓度达到最大，发酵12-22h菌体浓度稳定；发酵液pH值先平稳后急速上升至pH值8．6左右，之后趋于平稳；6～10h达到碳氮源利用高峰，14h后氨基酸态氮含量略微回升；乙酸于10h质量浓度最大，10～12h迅速下降后趋于平稳；酶活于12h达到最大值92．9U／mL，之后，利用流加氨苄的对照罐发酵，验证了发酵特性曲线的可靠性，菌体质粒稳定性得到提升，最大酶活优化为125．2U／mL。此研究对于产酮基还原酶的基因工程菌进一步的发酵优化具有指导意义。

麦迪霉素产生菌中与孢子色素聚酮体生物合成相关的酮基还原酶基因

研究了麦迪霉素产生菌-生米卡链霉菌1748的原生质体形成、再生和DNA转化条件,建立了生米卡链霉菌1748的DNA转化系统.麦迪霉素产生菌酮基还原酶(MKR)基因利用大肠杆菌-链霉菌穿梭温敏型质粒pKCll39(Am^R)进行基因中断实验,结果表明了发生同源交换的重组子在含Am的MY培养基上形成白色孢子,而生米卡链霉菌1748在MY培养基上形成灰色孢子.以MKR基因为探针的South-ern杂交结果证明重组子中确实发生了同源交换,发生了基因中断的重组子仍然产生麦迪霉素.这一结果证明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的生物功能是参与麦迪霉素产生菌中决定孢子色素的聚酮体的生物合成,与麦迪霉素的生物合成无关.重组质粒pCN8B12来自麦迪霉素产生菌基因文库,是以pNJ1为载体,插入了28kbDNA片段,该片段中既有与actⅠ同源的区域也有与actⅢ同源的区域.

美达霉素产生菌中立体专一性酮基还原酶基因med-ORF12的表达

美达霉素是链霉菌产生的具有强抗肿瘤活性的芳香聚酮类抗生素,其砒喃环并内酯结构对于其抗癌活性非常重要。位于美达霉素生物合成基因簇中的基因med-ORF12编码立体专一性酮基还原酶,可能参与美达霉素的砒喃环并内酯结构中手性中心(C3S)的形成,但在美达霉素产生菌中的功能和表达还未曾研究。【目的和方法】为了研究med-ORF12在野生菌中的表达情况以及与美达霉素生物合成的关系,本文采用了原核表达、抗体制备、免疫杂交等技术方法对这个基因展开了体内表达研究。【结果】首先利用pET载体建立了med-ORF12的原核表达系统,在优化诱导表达条件的基础上获得了可溶性目的蛋白,制备了相应的多抗血清;然后利用多抗血清对美达霉素产生菌中的基因med-ORF12的表达情况进行了检测,表明在美达霉素产生菌中参与次生代谢的med-ORF12在稳定期大量表达,同时伴随美达霉素的大量积累。【结论】这些结果表明在美达霉素产生菌中,基因med-ORF12参与次生代谢,其表达与美达霉素生物合成有一定相关性。

共价交联捕获聚酮合成中的酮基还原酶和酰基载体蛋白结构域的瞬时复合物

【背景】在模块化聚酮合成酶(polyketidesynthase,PKS)的催化过程中,催化结构域与同源酰基载体蛋白(acyl-carrierprotein,ACP)之间的蛋白质-蛋白质相互作用起重要作用,但这种瞬时可逆的相互作用难以捕捉分析。【目的】获得ACP和酮基还原酶(ketoreductase,KR)相互作用的蛋白复合物。【方法】在KR和ACP之间的Linker上插入烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶切位点,通过双功能马来酰亚胺试剂BMH将KR和ACP共价交联,随后TEV酶切检测交联结果。调整反应条件,使交联效率最大化。根据KR-ACP交联复合物与体系内其他蛋白标签和分子量的差异,通过亲和层析和凝胶过滤等纯化手段,获得纯度较高的KR-ACP稳定交联复合物。【结果】单独表达的KR和ACP结构域交联不成功,融合表达的KR+ACP双结构域可以有效交联,结合使用亲和层析和凝胶过滤等纯化手段成功获得纯度较高的复合物。该策略可运用于多个KR和ACP的共价交联。【结论】建立了捕获并纯化KR和ACP瞬时相互作用复合物的有效方法,为后期晶体结构的解析、KR与ACP相互作用机理的揭示及参与相互作用关键氨基酸的鉴定提供了实验基础。

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列 ,利用PCR技术 ,从克隆质粒和欧文氏菌 (Erwiniasp .)SCB1 2 5染色体中重新扩增得到含有 2 酮基醛糖还原酶A和B( 2 KRA和B)基因的片段 ,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体 pBL并转化大肠杆菌DH5α后 ,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上 ,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活并作为阳性筛选标记 ,再将此突变基因构建到分配不稳定型质粒pBR32 2上 ,导入宿主菌后与染色体上正常基因进行同源重组交换 ,筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢 ,实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体 2 酮基古龙酸 ( 2 KLG)打下基础。

大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶110位天冬酰胺突变后的结构与功能

3-酮基脂酰ACP还原酶催化3-酮基脂酰ACP还原为3-羟基脂酰ACP,是细菌脂肪酸合成反应的关键酶之一.为了明确该酶中110位的保守天冬酰胺残基在酶催化活性和酶结构中的作用,本研究采用基因定点突变和蛋白质表达纯化技术,获得了大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶FabG的两个突变蛋白:FabG N110Q和FabG N110L.圆二色谱结果显示,天冬酰胺残基的突变改变了FabG的空间结构,使突变蛋白的α螺旋结构明显增加.以3-酮脂酰ACP为底物的酶活性测定表明,突变蛋白的酶活性均有下降,但残存的酶活性达到了FabG的75%以上.突变蛋白FabG N110Q和FabG N110L具有3-酮基脂酰ACP还原酶的活性,能在体外重建细菌脂肪酸合成反应.对fabG温度敏感突变株的遗传互补分析表明,FabG蛋白110位天冬酰胺突变为谷氨酰胺或亮氨酸后,在一定的条件下仍能互补大肠杆菌的生长.本研究结果提示,FabG 110位的天冬酰胺残基不是参与3-酮基脂酰ACP还原酶催化反应的必需氨基酸,它只是作为结构氨基酸,在维持FabG的空间结构的稳定性方面起作用.

3-酮基嘌呤还原酶(TSC10)基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

TSC10基因所编码的3-酮基嘌呤还原酶是酵母中神经酰胺合成的重要因子。设计了一种从酵母中提取神经酰胺经济、便捷、高效的方法:(1)利用构建含有TSC10基因的毕赤酵母GS115表达载体p PIC3.5K-TSC10;(2)电转化法将该表达质粒转化到GS115感受态细胞中;(3)用G418筛选以及PCR鉴定;(4)使用qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测。结果经过G418筛选以及PCR鉴定后确定获得了包含TSC10基因的毕赤酵母转化子,经过qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测后发现TSC10基因在20个阳性菌株中均可以稳定、高效表达。成功构建了3-酮基嘌呤还原酶高表达的毕赤酵母菌株,并为后续获得高收率神经酰胺奠定了基础。

乳酸克鲁维酵母常温常压等离子体诱变选育及其突变株整细胞催化特性

采用常温常压等离子体(ARTP)诱变方法,以耐20 g/L的苯乙酮毒性和酮基还原酶酶活作为筛选标记,对乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)进行选育,得到酮基还原酶酶活2.72 U/m L的突变菌株KL5,并研究了该菌株在不同碳源、氮源中的生长特性及对底物苯乙酮转化能力。结果表明,蔗糖、酵母浸粉分别是突变株的最佳碳源和氮源;在一次添加苯乙酮20 g/L底物,蔗糖22.0 g/L,酵母浸粉10.0 g/L,磷酸二氢钾3.0 g/L,七水合硫酸镁1 g/L的催化条件下,28℃、200 r/min转化48 h,诱变菌株KL5对苯乙酮转化率可达到91.8%,比出发菌株提高2.5倍。该菌株具有广阔的生物催化应用前景。

增加aveBⅣ基因拷贝数对于表柔红霉素产生菌发酵单位的影响

表柔红霉素是表阿霉素的半合成前体,通过中断dnmV基因,并将酮基还原酶aveBⅣ基因导入,可以将柔红霉素产生菌改造成表柔红霉素产生菌。在此基础上构建含有两个aveBⅣ表达单元的整合型质粒,并将其转入原有的表柔红霉素产生菌MHJ-02-30-1,使菌株内aveBⅣ的表达拷贝数由1个增加到3个。发酵验证表明,增加aveBⅣ基因拷贝数可以显著提高表柔红霉素的产量。目的菌株比出发菌株表柔红霉素的发酵单位提高了一倍以上。本文的工作为表柔红霉素发酵的产业化提供了有效途径。

转化奎宁酮为(R)-3-奎宁醇菌株的筛选及转化条件优化

(R)-3-奎宁醇是一种用于合成各类药物的重要手性砌块,以奎宁酮盐酸盐为唯一碳源,筛选得到一株能够将奎宁酮不对称还原为(R)-3-奎宁醇的菌株X15。常规生理生化鉴定和18S rDNA序列分析表明,菌株X15属于粘红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa,定名为R.mucilaginosa X15。结果显示,菌株X15具有酮基还原能力和辅酶再生能力,在100 mL反应体系中可将奎宁酮还原为(R)-3-奎宁醇,转化率90%,ee值为88%。