稳定同位素稀释－质谱分析法用于肝硬化病人血浆α－酮异己酸的定量分析

用稳定核素稀释－质谱分析法对２０例肝硬化病人和３０例正常人血浆α－酮异己酸（ＫＩＣ）含量进行了测定，结果病人和正常人分别为２１．４１±１．６４、４４．０７±１．５１μｍｏｌ／Ｌ（±ＳＥ），团体ｔ检验差异非常显著（Ｐ＜０．００１）。对肝硬化时这一变化的意义及可能原因作了简要讨论。

不透明红球菌转化合成α-酮异己酸培养基优化

利用基于统计学的方法对不透明红球菌(Rhodococcus opacus)DSM 43250转化合成α-酮异己酸(KIC)的培养环境进行优化。采用Plackett-Burman(PB)设计筛选获得对KIC产量具有显著影响的关键营养因子:(NH4)2SO4、麦芽膏和NaNO3。通过最陡爬坡实验、Box-Behnken实验设计和SAS软件回归分析建立了KIC产量关于3个关键营养因子的二次多项式模型,并以模型求解确定最佳培养条件(g/L):(NH4)2SO4 0.23,麦芽膏2.42,NaNO3 1.43。在此培养条件下,KIC的理论最高产量为23.98 mg/L,在验证实验中KIC最高产量为23.93 mg/L,比优化前(3.72 mg/L)提高了6.43倍。

以L-亮氨酸为底物一步法生物合成α-酮异己酸

α-酮异己酸是重要的有机合成和药物合成中间体,在食品、医药和化工行业中应用广泛。目前,α-酮异己酸的合成以化学法为主,需要高成本的催化剂或特殊的起始结构,导致α-酮异己酸生产成本较高。首次在食品安全性菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168中异源表达了普通变形杆菌(Proteus vulgaris)来源的L-氨基酸脱氨酶,以重组枯草芽孢杆菌作为全细胞催化剂、L-亮氨酸为底物实现了α-酮异己酸的一步法生物合成。其次,针对全细胞催化条件进行优化,最优条件(全细胞催化剂20 g/L、L-亮氨酸浓度100 mmol/L、反应温度45℃、pH 10.0、MgCl 2浓度5 mmol/L)下,转化24 h,可获得3.66 g/L的α-酮异己酸,且重复转化3次后,固定化细胞比游离细胞的再利用率提高了37.3%。该研究成功实现了以食品安全菌株B.subtilis 168为宿主一步法生物合成α-酮异己酸,为α-酮异己酸以及其他重要α-酮酸的工业化安全合成提供了新策略。

亮氨酸脱氢酶催化底物偶联法合成α-酮异己酸

构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系,打破氧化脱氨反应平衡,同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD^+的高效循环再生.基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数,考察了不同酮酸底物对于底物偶联反应效率的影响,选择转化率最高的2-丁酮酸作为偶联底物,使α-KIC产率由单步氧化反应的2. 75%提高至66. 82%.通过考察底物浓度、pH值、NH_4^+浓度和辅酶NAD^+浓度等反应条件对偶联反应效率的影响,使α-KIC产率进一步提高至83. 25%,同时辅酶NAD^+的总转化数(TTN)达到5. 88×105.通过改变底物L-亮氨酸和2-丁酮酸的摩尔比,能够将α-KIC的产率进一步提高至92. 74%.

α-酮异己酸的生物合成研究进展

α-酮异己酸是重要有机酸、药用氨基酸合成前体、新陈代谢调节因子和治疗药物,其生物合成路径条件温和,环境友好。本文对α-酮异己酸的生理功能和体内代谢机理进行了归纳,并着重对其生物合成路径的研究进展进行了综述。现有研究表明,α-酮异己酸可用葡萄糖为底物,通过代谢工程改造的谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌工程菌发酵合成,但产物浓度较低;或以L-亮氨酸为底物,经氨基酸转氨酶、氧化酶、脱氨酶、重组工程菌或全细胞催化转化合成,产物浓度较高。α-酮异己酸高产菌株的筛选、利用代谢工程方法对菌株进行改造以构建高效工程菌、发酵与分离提取工艺优化等问题,是今后需要研究的重点。

半疏水基质阴离子交换晶胶对α-酮异己酸的层析吸附特性

针对微生物法制备α-酮异己酸中目标物分离纯化困难的问题,以甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸丁酯为基质单体,采用冷冻结晶致孔和聚合法,制备半疏水基质晶胶,并接枝N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化铵,得到半疏水基质阴离子交换晶胶,用于α-酮异己酸的层析分离。结果表明:在流速为1 cm×min^(-1)和上样质量浓度为2.0 mg×mL^(-1)的条件下,半疏水基质阴离子交换晶胶对牛血清白蛋白和α-酮异己酸的吸附容量分别达4.42和17.56 mg×mL^(-1),其对α-酮异己酸的吸附容量随NaCl浓度的增大而降低,且用浓度高于0.3 mol×L^(-1)的NaCl溶液可实现洗脱。研究结果可为微生物法制备α-酮异己酸的分离材料选用提供参考。

伊犁马对补喂α-酮异己酸的吸收及其某些相关代谢的研究

为探究伊犁马对补喂不同水平α-酮异己酸的吸收及其某些相关代谢,采取单因素多水平试验设计方法,选取20匹年龄为1岁,体重(295.25±25.15)kg的伊犁马,分成4组,每组5匹。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别补喂6、12、18 gα-酮异己酸,进行为期25 d的试验。在试验第25天采集血液样品。结果表明:(1)随着α-酮异己酸补喂水平的增加,血浆中α-酮异己酸浓度的变化呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,补喂α-酮异己酸1 h后各试验组血浆α-酮异己酸浓度分别提高了11.2%、7.86%和21.51%,且均达到了峰值(P>0.05);(2)随着α-酮异己酸补喂水平的增加,血浆中β-羟基-β-甲基丁酸浓度的变化呈先下降后上升再下降的趋势。与对照组相比,各试验组补喂前0 h血浆β-羟基-β-甲基丁酸浓度呈下降趋势,补喂后1、2、4 h血浆β-羟基-β-甲基丁酸浓度均有所升高(P>0.05);(3)与对照组相比,各试验组血浆α-酮异己酸和β-羟基-β-甲基丁酸浓度均差异不显著(P>0.05);试验Ⅱ组和试验Ⅲ组血浆亮氨酸浓度分别提高了22.40%和22.24%(P>0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅲ组血浆异亮氨酸浓度极显著降低(P<0.01);血浆缬氨酸浓度显著降低(P<0.05);试验Ⅲ组血浆赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸和谷氨酰胺浓度均显著降低(P<0.05);各试验组血浆5-羟色胺浓度极显著降低(P<0.01);试验Ⅲ组血浆三甲基组氨酸浓度降低了18.74%(P>0.05)。补喂α-酮异己酸提高了伊犁马血浆α-酮异己酸浓度,且各试验组均在补喂后1 h达到峰值;提高了血浆β-羟基-β-甲基丁酸和亮氨酸的浓度。通过补喂不同水平的α-酮异己酸,改变了伊犁马对某些氨基酸的吸收利用。

不透明红球菌转化合成α-酮异己酸的培养条件优化

利用基于非完全平衡块原理的Plackett-Burman法和响应面法对不透明红球菌(Rhodococcus opacus DSM 43250)转化合成α-酮异己酸(KIC)的培养条件进行优化,以提高KIC的产量.首先采用Plackett-Burman(PB)设计对影响KIC产量的6个因素的效应进行评价,筛选出具有显著影响的关键因素——接种量、装液量和初始pH,然后通过最陡爬坡实验和Box-Behnken实验设计对关键因素的最佳水平范围进行研究,并利用SAS软件回归分析建立了二次多项式模型,通过模型求解确定最佳培养条件为:接种量6.93%,装液量33.38 mL,初始pH 7.6.在优化后的培养条件下,KIC的理论最高产量为31.08 mg/L,在验证实验中KIC最高产量为30.97 mg/L,比初始产量23.93 mg/L提高了29.42%,为进一步的发酵放大奠定了基础.

补喂亮氨酸对伊犁马血浆氨基酸及其主要相关代谢物浓度的影响

本试验通过补喂不同水平的亮氨酸(Leu),探究其对伊犁马血浆中氨基酸浓度的影响,和Leu及其代谢产物α-酮异己酸(KIC)、β-羟基-β-甲基丁酸(HMB)的吸收规律。采用单因素多水平试验设计方法,选取20匹年龄为1岁、体重为(321.68±25.7)kg的伊犁马,随机分为4组,每组5匹(3♂+2♀)。对照组不补喂Leu,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别补喂17、34、51 g Leu,进行为期21 d的试验,在试验第21天采集血液样品。结果表明:(1)与对照组相比,试验Ⅲ组血浆Leu浓度升高90.53%(P<0.05),试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血浆异亮氨酸浓度分别降低32.18%(P<0.05)、50.53%(P<0.01)、39.27%(P<0.05),试验Ⅲ组血浆缬氨酸浓度有下降的趋势(P=0.067)。试验Ⅰ、Ⅲ组血浆谷氨酸浓度分别降低37.07%(P<0.01)、26.52%(P<0.05)。(2)饲喂前,试验Ⅲ组较对照组血浆KIC浓度升高30.56%(P<0.05),饲喂后1 h各组血浆KIC浓度达到峰值,各组差异不显著(P>0.05),饲喂后2 h,与对照组相比,试验Ⅲ组血浆KIC浓度升高43.54%(P<0.05)。在饲喂后4 h,与对照组相比,试验Ⅲ组血浆KIC浓度升高53.91%(P<0.01)。补喂Leu对伊犁马血浆HMB浓度无显著影响(P>0.05)。由此得出,饲粮中添加Leu可提高伊犁马血浆中Leu、KIC的浓度,降低异亮氨酸的浓度。

非侵入性肝脏线粒体功能评估新方法——^(13)C呼气试验

线粒体在细胞能量代谢中具有重要作用,线粒体功能紊乱与肝病的发生和发展相关。活体内肝脏线粒体功能评估有助于了解特定肝脏功能、探讨肝病的致病机制,是诊断肝病、评估治疗手段和预后的有用工具。^(13)C呼气试验由于其非侵入性,且具有较高的准确性以及独特的实时检测特性,可用于活体内肝脏线粒体功能的评估。本文就此作一综述。

稳定同位素稀释一质谱技术分析KIC的负化学电离法

α－酮异己酸（ＫＩＣ）是亮氨酸在体内经转氨后的产物，本文以Ｄ３－ＫＩＣ为同位素稀释内标准物，经α－Ｂｒ－五氟苯酯化后，用ＧＣ／ＭＳ负化学电离法测定血浆ＫＩＣ的浓度。分析精度：批内ＣＶ为０．７９％，批间ＣＶ为０．７８％，对１０例正常人血浆分析结果，平均含量为４４．０７±２．８７μｍｏｌ／Ｌ。