突变型聚酮合成酶酮还原酶域的表达及序列分析

为验证糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域EryKR1中的控制底物特异性位点,以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增出α6和α7之间的氨基酸残基RHGVIEMP对应的核苷酸序列被替换的EryKR1酶域DNA片段eryKR1M,并克隆到表达载体pET-28a上,构建了质粒pET-ery KR1M,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-ery KR1M)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析表明重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-eryKR1M)中的重组蛋白质表达量占全菌胞内可溶性蛋白质的5.7%。E.coli BL21(pET-ery KR1M)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组菌E.coliBL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示突变型的重组菌E.coli BL21(pET-ery KR1M)失去野生型重组菌E.coliBL21(pET-ery KR1)2还原环己酮的能力,结合EryKR1酶域与放线菌素聚酮还原酶ActKR的氨基酸序列比对和二维结构比较的结果,推测α6和α7间氨基酸残基RHGVIEMP为EryKR1酶域中的底物结合口袋组成单元,对酶活性保持非常重要。

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.

重组的葡萄糖脱氢酶催化辅酶的再生性质

为解决生物催化环己酮还原反应中的辅酶再生问题,扩增了枯草芽孢杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因(gdh),构建了表达载体pET-gdh,转化到Escherichiacoli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coliBL21(pET-gdh1).经IPTG诱导后,葡萄糖脱氢酶粗酶液的比酶活达18.4U/mg蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明重组蛋白表达量占全菌胞内可溶性蛋白质的54.1%.添加E.coliBL21(pET-gdh1)到以异源表达糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域基因的重组菌E.coliBL21(pET-eryKR2)为催化剂的环己酮还原体系中,利用气相色谱分析转化液,显示此条件下产物环己醇的得率为93.24%,是未添加E.coliBL21(pET-gdh1)转化反应产率的3.4倍,说明E.coliBL21(pET-gdh1)能为此环己酮还原系统完成还原态辅酶NADPH的再生.