蒺藜苜蓿叶绿素酸酯a加氧酶(MtCAO)基因的克隆与功能分析

叶绿素含量直接影响植物光合效率,从而决定其生物量。叶绿素酸酯a加氧酶(CAO)催化叶绿素酸酯a转化成叶绿素酸酯b,是叶绿素合成的限速酶之一。本研究克隆了蒺藜苜蓿MtCAO,该基因编码531个氨基酸。进化分析表明,MtCAO与双子叶植物的CAO亲缘关系较近。高等植物CAO基因的结构保守,均含有9个外显子。MtCAO主要在绿色组织尤其是叶片中高丰度表达。瞬时表达拟南芥原生质体试验显示,MtCAO-GFP融合蛋白定位于叶绿体。表达模式分析表明,茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol·L^-1)及黑暗处理抑制MtCAO的表达,而24 h内NaCl(100 mmol·L^-1)及聚乙二醇(PEG,5%)处理先诱导后抑制其表达,且该基因受昼夜节律调控。这与对MtCAO启动子区顺式作用元件的预测结果一致。类似于超表达AtCAO的拟南芥,超表达MtCAO的拟南芥株系叶色正常,叶绿素含量及鲜重与野生型差异不显著,推测是由于MtCAO高度保守的A结构域中的降解子导致的。

单核细胞吞噬细胞脂加氧酶酶促反应动力学的研究

采用10.000×g 离心细胞上清,对脂加氧酶的酶促反应动力学进行研究。结果表明,以亚油酸作为酶促反应底物,酶活性在1。5min 达到最大,其 km(app)=61.1μM;活性的最适 pH 在8.3附近,最适温度为25～30℃;Mg^(2+)对酶活性具有促进效应,而去甲二氢愈创木酸和维生素 E 均可强烈抑制该酶活性。

杧果MiCAO基因的克隆及植物超表达载体构建

叶绿素是植物重要的光合色素之一,其含量影响着植物最终合成的生物量或产量。CAO(Chlorophyllide a oxygenas)是叶绿素生物合成的关键限速酶之一,主要参与叶绿素b的形成。为探究杧果CAO基因的生物学功能,本研究利用RACE技术,从杧果‘金煌’品种中克隆得到MiCAO基因并对其蛋白序列进行相应的生物信息学分析、构建其植物超表达载体进行亚细胞定位和基因功能验证。本试验克隆了杧果MiCAO基因,该基因全长cDNA序列为2151 bp,开放阅读框为1608 bp,编码535个氨基酸。进化树分析表明,MiCAO蛋白与双子叶植物的开心果Pv CAO蛋白的亲缘关系最近。利用植物瞬时表达技术转化烟草,对MiCAO蛋白进行亚细胞定位显示MiCAO蛋白定位于细胞质和细胞核中;对MiCAO进行基因功能验证,结果表明转基因株系表型与野生型无明显差异,推测MiCAO基因可能不是调控叶绿素生物合成途径中的主效基因,为研究杧果叶绿素生物合成提供了一定的理论参考依据。