脂肪组织甘油三酯水解酶参与脂肪分解调控

循环中游离脂肪酸增高与肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关,其主要来源于脂肪细胞内甘油三酯水解。调控脂肪分解的脂肪酶主要包括激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)和最近发现的脂肪组织甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL),后者主要分布在脂肪组织,特异水解甘油三酯为甘油二酯,其转录水平受多种因素调控。CGI-58(属于α/β水解酶家族蛋白),可以活化ATGL,基础条件下该蛋白和脂滴包被蛋白(perilipin)紧密结合于脂滴表面,蛋白激酶A激活刺激脂肪分解时,CGI-58与perilipin分离,进而活化ATGL。

α-氨基酸酯水解酶突变体催化合成头孢丙烯

目的通过α-氨基酸酯水解酶突变体合成头孢丙烯的工艺条件实验,获得相关实验数据,为推行头孢丙烯的绿色生产技术打下基础。方法通过定向进化对野生型α-氨基酸酯水解酶进行改造,用突变体酶催化合成头孢丙烯,考察了包括pH、温度、酶浓度、母核/侧链投料比及有机溶剂等多个因素对酶法合成头孢丙烯的影响。结果对野生型AEH酶进行分子改造,筛选出一株突变体。动力学数据分析表明,突变体酶比野生型更适合用于头孢丙烯的合成。在突变体酶催化合成头孢丙烯的过程中,体系最适合的pH为6.0;最适温度为30℃;底物浓度为50mmol/L;最适的母核侧链比为1:2;最适的反应体系为15%异丙醇-水溶液。结论相对于野生型的α-氨基酸酯水解酶,该突变体更适合用于头孢丙烯的合成,实验数据为头孢丙烯酶法合成的实际应用打下基础。

响应面法优化Aspergillus oryzae Cs007产酯水解酶发酵条件

对米曲霉菌株Aspergillus oryzae Cs007产酯水解酶发酵条件进行了研究。首先通过单因子实验确定最佳碳源为橄榄油、最佳氮源为蛋白胨、最佳表面活性剂为阿拉伯胶;再利用Plackett-Burman设计筛选出具有显著效应的3个因素:蛋白胨、KH2PO4、阿拉伯胶;然后通过最陡爬坡实验和响应面法(RSM)分析确定了显著因素的最优水平;最后通过单因子实验确定最佳摇床转速和培养时间。优化后的产酶条件为:橄榄油1%(体积分数),蛋白胨1.76%(质量浓度),KH2PO40.11%(质量浓度),MgSO40.05%(质量浓度),NaCl 0.05%(质量浓度),阿拉伯胶0.37%(质量浓度),起始pH值5,培养温度30℃,摇床转速200r.min-1,培养时间48h。优化条件下所产酯水解酶酶活达6.49U.mL-1,比初始酶活2.8U.mL-1提高了1.32倍。

对苯二甲酸单羟乙酯水解酶结构与功能的研究进展

聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)作为目前广泛使用的塑料之一,其废弃物对全球环境造成了严重污染。PET降解酶(polyethylene terephthalate hydrolase,PETase)的发现为处理PET废弃物提供了一种绿色环保的途径。尽管PETase降解PET会产生中间产物,抑制水解酶的进一步降解,影响酶的催化效率,但对苯二甲酸单羟乙酯水解酶[mono(2-hydroxyethyl)terephthalate hydrolase,MHETase]通过与PETase协同作用,将PETase水解产生的中间产物MHET高效降解为乙二醇(ethylene glycol,EG)和对苯二甲酸(terephthalic acid,TPA)。MHETase对MHET表现出极高的特异性,是完全降解PET的关键酶。本文全面梳理了MHETase的三维结构、底物结合模式以及催化反应机理等,介绍了该酶降解活性的结构特征和关键残基,以及酶工程改造的研究进展。同时,对基于MHETase支架结合PETase开发定制的酶促PET降解系统进行了展望,为设计和开发更加高效的PET水解酶体系提供了参考。

有机溶剂和聚电解质提升MHET水解酶催化性能

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是一种广泛应用的塑料,但由于其难以自然降解导致严重的污染问题.PET水解酶和对苯二甲酸单乙二醇酯水解酶(MHETase)被认为是级联降解PET的关键酶,但尚未实现工业应用,本文针对MHETase开展稳定性研究以促进其工业开发.首先,选用4种不同的水溶性有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇和乙腈构建反应体系探寻最佳的MHETase反应条件,随后进一步研究有机溶剂和聚电解质预处理对MHETase催化活力和稳定性的影响.结果表明,当反应体系DMSO含量不高于10%时MHETase的活力几乎不受影响,其他条件下有机溶剂均会抑制MHETase活性,但这种抑制作用是可逆的,即该抑制可以通过去除有机溶剂来恢复.此外,低浓度的有机溶剂预处理能够提高MHETase的催化活力,且DMSO预处理能够提升MHETase的储存稳定性及热稳定性,MHETase在4℃下10%DMSO中储存96 h后的活力为原有活力的113%,在30℃下10%DMSO中孵育6 h后也能保持原有活力的103%.研究发现,MHETase活力可以通过阴、阳离子聚电解质孵育来提升,与等量阴、阳离子聚电解质共孵育的MHETase在4℃下10%DMSO中储存144 h也能保持118%的活力,但与DMSO预处理相比,聚电解质预处理对MHETase活力提升程度有限.本研究系统考察了有机溶剂和聚电解质对MHETase催化性能的影响,并指出DMSO和聚电解质的预处理有助于MHETase在常温下的储存和应用,为MHETase的工业应用提供了更多参考.

α-氨基酸酯水解酶合成头孢克洛

用实验室自制的α-氨基酸酯水解酶(AEH)催化合成了头孢克洛。考察了pH值、温度、酶浓度、7-ACCA/D-PGM·HCl投料比、有机溶剂和D-PGM·HCl流加方式等多个因素对该反应的影响。所得最优工艺组合为:pH 6.1,温度15℃,7-ACCA浓度100 mmol/L,投料比1∶1.3,反应体系含25%乙醇,加料方式为侧链流加。优化工艺后头孢克洛的转化率达80%以上,为其酶法合成的进一步发展提供了参考。

肿瘤坏死因子α诱导的胰岛素抵抗对小鼠脂肪甘油三酯水解酶的影响

目的探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的胰岛素抵抗（IR）对糖脂代谢及脂肪甘油三酯水解酶（ATGL）的影响。方法健康雄性C57BL／6J小鼠随机分为2组，分别给予腹腔注射TNF-α6μg·kg^-1·d^-1（TNF组，20只）和等体积生理盐水（NC组，20只）共7d。采用2-脱氧-^3H葡萄糖（2-DOG）为示踪剂的扩展胰岛素钳夹技术评价小鼠胰岛素敏感性和糖代谢变化，用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白质印迹法分别测定代谢相关基因ATGL、激素敏感性脂酶（HSL）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）等组织mRNA或血浆蛋白表达水平的变化。结果TNF-α处理后，小鼠空腹血糖（FBG）、血浆胰岛素和游离脂肪酸（FFA）水平均增高。在胰岛素钳夹术中，TNF组血浆胰岛素水平明显高于NC组[（341．7±17．7）vs（84．7±5．5）mU／L，P〈0．01]，胰岛素对FFA的抑制作用明显障碍[FFA，TNF组：（0．82±0．03）mmol／L，NC组：（0．43±0．07）mmol／L，P〈0．01]。TNF组葡萄糖输注率（GIR）明显低于NC组[（39．1±2．3）vs（54．2±2．2）mg·kg^-1·min^-1，P〈0．01]，骨骼肌葡萄糖摄取率（MGU）也明显低于NC组[（15．8±1．7）vs（20．9±2．5）μmol·100g^-1·min^-1，P〈0．01]。TNF组脂肪组织ATGL mRNA表达明显低于对照组（0．85±0．09vs1．37±0．12，P〈0．01），ATGL蛋白水平也明显低于对照组（0．53±0．03vs0．65±0．05，P〈0．05）。TNF组小鼠脂肪组织PPARγ mRNA表达明显低于对照组（0．83±0．07VS1．07±0．07，P〈0．05）。结论在TNF-α诱导的IR中，ATGL在脂代谢相关通路中起着调控作用。

聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶检测方法的研究进展

聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)是应用最广泛的合成聚酯之一。由于PET不易降解,在环境中积累,对陆地、水生生态系统以及人类健康构成严重威胁。基于生物酶催化的生物降解策略为PET回收利用提供了一种绿色途径,在过去20年间,已发现了多种PET水解酶,并通过蛋白质工程等手段来改善这些酶的降解性能,但是目前仍未找到适合大规模工业应用的PET水解酶。利用传统的检测方法筛选PET水解酶是一个缓慢而复杂的过程。为了促进PET酶法回收的工业化应用,需要研发高效的检测方法。近年来,研究人员开发了多种表征PET水解酶的分析方法。本文总结了可用于筛选PET水解酶的检测方法,如高效液相色谱法、紫外吸光度法和荧光激活液滴分选法等,并对其在筛选PET水解酶的应用方面进行了展望。

全细胞高通量筛选α-氨基酸酯水解酶突变体的方法

【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的α-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定α-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在(0.1?0.6)×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯-比尔定律,平均回收率为99.8%?101.3%。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选,获得3株kcat提高40%以上,4株半失活温度较野生型提高5°C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应,达到高通量筛选的要求。

红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。

脂肪甘油三酯水解酶的研究进展

胰岛素抵抗等代谢疾病的发生与脂代谢紊乱密切相关。细胞中的脂肪主要储存在一个以中性脂为核的细胞器——脂滴(lipid droplet,LD)中。脂肪甘油三酯水解酶(adiposetriglyceride lipase,ATGL)是在脂滴上发现的水解甘油三酯的脂肪酶。除脂肪组织外,ATGL也广泛存在于骨骼肌等多种非脂肪组织中,并发挥着重要的生理功能。越来越多的研究表明,ATGL与中性脂质贮存异常、胰岛素抵抗等代谢疾病密切相关。运动可以通过改变ATGL的表达起到调控脂代谢的作用,进而在防治胰岛素抵抗等代谢疾病中发挥作用。

利拉鲁肽通过脂肪甘油三酯水解酶通路改善肝细胞脂肪变性

目的 研究胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物利拉鲁肽是否通过脂肪甘油三酯水解酶（ATGL）通路改善肝细胞脂肪变性及其机制.方法 体外培养人类肝癌细胞系HepG2细胞随机分为：正常对照组（NC组）、脂肪变性肝细胞模型组（M组）、利拉鲁肽组（L组）、一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）抑制剂（Compound C）＋利拉鲁肽组（CC组）.其中M组选择0.5 mmol/L游离脂肪酸（FFAs）24 h诱导细胞脂肪变性;L组选择100 nmol/L利拉鲁肽干预脂肪变性肝细胞模型24 h;CC组为添加10 mmol/L Compound C的脂肪变性肝细胞模型再以100 nmol/L利拉鲁肽干预.Western blotting法检测各组肝细胞中磷酸化AMPK（p-AMPK）、AMPK、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及ATGL蛋白表达.组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验.结果 与NC组相比,M组细胞内p-AMPK/AMPK、ATGL水平下降,p-mTOR/mTOR水平升高（分别为0.208±0.069比0.444±0.106、0.112±0.038比0.333±0.052、0.421±0.105比0.126±0.041,t=3.620、5.900、5.060,均P〈0.05）;与M组相比,L组p-AMPK/AMPK及ATGL水平显著性升高,p-mTOR/mTOR水平显著性降低（分别为0.391±0.076比0.208±0.069、0.233±0.058比0.112±0.038、0.230±0.066比0.421±0.105,t=2.810、3.218、3.281,均P〈0.05）;CC组较L组肝细胞内p-AMPK/AMPK及ATGL水平显著性降低,p-mTOR/mTOR水平显著性升高（分别为0.234±0.061比0.391±0.076、0.144±0.030比0.233±0.058、0.366±0.058比0.230±0.066,t=2.414、2.360、2.334,均P〈0.05）.结论 利拉鲁肽可能通过激活AMPK-mTOR信号通路,增加肝细胞内ATGL蛋白表达水平,从而降低脂肪变性肝细胞内脂滴和TG含量,改善肝细胞脂肪变性.

外周血单核细胞甘油三酯水解酶的表达与代谢综合征的相关性

目的探讨代谢综合征(MS)患者外周血单核细胞(PBMC)中甘油三酯水解酶(ATGL)的表达与MS的关系。方法选取2010年5月至2011年9月于心内科住院及门诊就诊的MS患者56例(MS组),同时选取健康查体志愿者55例为正常对照组,检测并记录一般资料及血生化指标。采用实时荧光定量PCR检测患者外周血单核细胞ATGL mRNA表达;高频超声检测患者颈动脉内膜中层厚度,测量并计算颈动脉压力弹性系数和颈动脉僵硬度;参数间行Pearson线性相关及多元线性逐步回归分析确定参数之间的变化依存关系。结果与对照组相比,MS组外周血单核细胞ATGL mRNA表达显著增加[(7.04±3.66)vs(2.25±1.69),P<0.001],多元线性回归结果显示,年龄、甘油三酯(TG)和胰岛素抵抗指数是ATGL mRNA表达增加的独立危险因素;MS组颈动脉内膜中层厚度增加[(0.89±0.19)mm vs(0.56±0.12)mm,P<0.001]。多元线性回归结果显示,TG升高和ATGL mRNA表达增加是颈动脉内膜中层厚度增加的独立危险因素。结论 MS患者外周血单核细胞中ATGL mRNA的表达与MS发生发展及血管损伤密切相关。

重组α-氨基酸酯水解酶合成头孢曲嗪

为了探索酶法合成头孢曲嗪的产业化工艺路线,从红纹黄单胞菌Xanthomonas rubrillineans中克隆-氨基酸酯水解酶基因全序列,转化入大肠杆菌中表达。以头孢曲嗪的合成转化率为指标,分别考察纯化的重组-氨基酸酯水解酶合成头孢曲嗪的最适温度、最适pH和最佳底物摩尔比。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,重组-氨基酸酯水解酶的单体分子量为70 kDa。催化合成头孢曲嗪的最适pH为(6.0±0.1),最适温度为36℃。底物浓度约为7-ATTC 30 mmol/L、HPGM HCl 120 mmol/L,酶用量22 U/mL时,头孢曲嗪的转化率达到64.3%。结果为优化酶法合成头孢曲嗪的产业化工艺奠定了基础。

红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质

【目的】从红纹黄单胞菌中分离纯化了胞内α-氨基酸酯水解酶(AEH),并进行了酶学性质研究。【方法】采用乙酸丁酯破碎细胞,并相继用磷酸钙凝胶沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-50阴离子交换处理、CM Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化得到了电泳纯α-氨基酸酯水解酶,并研究了此酶的酶学性质。【结果】SDS-PAGE显示α-氨基酸酯水解酶的亚基分子量为70 kDa。酶促合成头孢克洛的最适pH为6.8,最适温度为42℃,在pH5.0-8.0和35℃以下,酶保持了良好的稳定性。Mn2+和Ca2+对酶活有一定的促进作用,Cu2+、Fe2+及高浓度的丙酮对酶活有强的抑制作用。AEH催化D-苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯和头孢克洛水解反应的kcat/Km分别为123.7±3.7 mmol-1.s-1.L、2.9±0.6 mmol-1.s-1.L和101.3±2.1 mmol-1.s-1.L,AEH对D-苯甘氨酸甲酯的催化效率最高。AEH催化双底物反应的机制为乒乓机制,催化合成头孢克洛的kcat为547.3±38.2 s-1。【结论】有关红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的酶学性质研究相对较少,本文的研究将为该酶催化合成β-内酰胺类抗生素的工业化应用提供重要参数。

α-氨基酸酯水解酶酶促合成β-内酰胺类抗生素的研究进展

β-内酰胺类抗生素是临床应用最为广泛的一类抗感染药物,在我国医药工业中占有十分重要的地位。由于β-内酰胺类抗生素的酶法合成比传统化学法更节能环保、经济,国外已有企业开始大规模应用酶法合成工艺。加强酶法合成β-内酰胺类抗生素研究对于我国医药产业具有十分重要的现实意义。本文主要综述了α-氨基酸酯水解酶的研究进展,并展望它在合成β-内酰胺类抗生素中的应用。

茶树酯型儿茶素水解酶鉴定及其检测体系的建立

本试验利用体外酶学方法,结合薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析,首次从茶树中检测到活性较高的酯型儿茶素水解酶(Galloylated Catechins Hydrolase,GCH)的存在。在酯型儿茶素水解酶催化下,酯型儿茶素发生水解反应,生成没食子酸(GA)和非酯型儿茶素。试验确立了酯型儿茶素水解酶的最适检测体系,在2.5 mL反应体系中包含0.2 mmol/L酯型儿茶素、2.4 mmol/L抗坏血酸、粗酶提取液若干(含0.1 mg酶蛋白)和0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.5),在30℃下,反应30 min。此外,试验利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析对该酶进行了初步纯化。

马铃薯酯酰基水解酶的特性研究

从马铃薯生产废水中提取分离马铃薯蛋白Patatin组分,并以对硝基苯乙酸酯为底物,研究了Patatin作为酯酰基水解酶的酶学性质。结果表明,马铃薯酯酰基水解酶在37℃时活性最高,在40~50℃的条件下具有热稳定性,70℃处理120min后酶失活;马铃薯酯酰基水解酶发挥酶活的最适pH为8.2;Fe^2+、Fe^3+、Mg^2+对马铃薯酯酰基水解酶具有活性激活作用,K^+、Ca^2+对马铃薯酯酰基水解酶活性具有抑制作用。此外,低浓度的Al^3+和Zn^2+对酯酰基水解酶的水解能力具有促进作用,高浓度的Zn^2+抑制了酯酰基水解酶的活性。

泛素羧基末端水解酶及其在肿瘤发生发展中的作用研究进展

泛素—蛋白酶体系统通过调控关键蛋白的泛素化和去泛素化介导多种细胞活动。泛素羧基末端水解酶在多种肿瘤组织中表达异常，作为去泛素化酶家族成员，可移除泛素化蛋白上的泛素分子，从而介导肿瘤发生中关键蛋白的泛素化水平，参与多种肿瘤的发生发展过程。本文对泛素羧基末端水解酶家族成员特点及其在肿瘤发生发展中的作用进行综述，以期为寻找肿瘤治疗新靶点提供线索。

基于水解酶的抗寄生虫前药研究

前药策略已被广泛应用于各种基于药剂学、药代动力学和药效学的药物优化。多数涉及前药转化的酶都属于水解酶,其中以酯水解酶和酰胺水解酶的研究最为广泛。本文综述了基于这两种水解酶的抗寄生虫前药的研究进展。