催化Aldol加成反应的新型枯草芽孢杆菌BS168酰基氨肽酶的表达和应用

从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组中的ORF32230出发,通过氨基酸序列分析推测其可能为酰基氨肽酶基因,并与典型的脯氨酸寡肽酶家族成员一致,含有2个独立的结构域,活性中心由催化三联体丝氨酸-天冬氨酸-组氨酸(Ser-Asp-His)组成.将BSU32230的基因片段与p ET-21a载体相连,转入BLP(DE3)表达菌中,在0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在及20℃条件下诱导表达该蛋白.利用硫酸铵沉淀与Ni亲和层析对BSU32230蛋白进行纯化,并通过实验证明该蛋白同时具有酯酶和肽酶2种活性.该酶最佳反应温度为50℃,最佳p H值为8.0,40℃下半衰期约29 h,在p H=4~10范围内稳定.该酶能够在有机相中催化不对称Aldol加成反应,且反应产物的立体选择性较好(84.6%).

乳杆菌产X-脯氨酰-二肽酰基-氨肽酶活性对契达干酪抗氧化活性及品质的影响

选取4株(干酪乳杆菌1.0319、瑞士乳杆菌1.0612、鼠李糖乳杆菌1.0911、植物乳杆菌1.0202)具有X-脯氨酰-二肽酰基-氨肽酶(X-prolyl-dipeptide acyl-aminopeptidase,Pep X)活性的乳杆菌,经过3次紫外诱变,诱变出具有高活性Pep X的菌株(UV-C3、UV-H3、UV-R3、UV-P3),将其添加到契达干酪中,分析在干酪成熟期间Pep X活性和抗氧化活性变化,建立二者间的相关性,并研究添加产Pep X乳杆菌对干酪品质的影响。结果表明,乳杆菌所产Pep X活性对契达干酪抗氧化活性及品质具有显著影响,且二者间呈极显著正相关(P<0.01)。随着干酪成熟时间的延长,干酪的Pep X活性及抗氧化活性逐渐上升,且在第90天达到最大值,其中,添加UV-R3菌株所产的Pep X活性均显著高于其他组(P<0.05),最大值为10.16 U/g,其抗氧化能力(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、羟自由基清除率、还原能力)均显著高于其他组(P<0.05),最大值分别为68.43%、67.56%、0.6843。在120 d后,随着酪蛋白的水解,干酪的苦味肽大量产生,且质构情况显著降低。在第120天时,干酪的风味感官得分达到最大值,均超过9.0分,因此可在成熟120 d后进行食用。

PPIB蛋白对结肠癌成瘤的影响和低氧机制

目的:研究肽酰脯氨基顺反异构酶B(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIB)蛋白对结肠癌细胞成瘤的影响,探讨结肠癌低氧发病的机制。方法:应用RNAi技术,构建下调PPIB蛋白表达的稳转结肠癌细胞株,移植到BALB/c裸鼠皮下,检测PPIB蛋白下调组与对照组的成瘤差异。TUNEL法检测两组移植瘤的细胞凋亡水平。低氧培养结肠癌细胞株,Western印迹法检测PPIB的表达水平与低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的关系。结果:下调PPIB蛋白表达后,在裸鼠皮下成瘤的能力显著减弱。SW480-si PPIB下调组的移植瘤体积显著小于SW480-NC对照组(P<0.01)。TUNEL检测显示下调组的癌细胞凋亡比例显著高于对照组(P<0.001)。在低氧环境下培养后,结肠癌细胞的PPIB蛋白表达水平随着低氧条件下HIF-1α的上调而升高(P<0.05)。结论:PPIB蛋白在结肠癌中因为低氧环境而表达升高,且在升高后通过抑制癌细胞的凋亡而发挥促进结肠癌形成和进展的作用,是一个极具临床应用价值的防治结肠癌的分子靶点。