酰基辅酶A合成酶中链家族成员3、微小RNA-653-5p在前列腺癌组织中的表达及其与患者临床病理特征、预后的关系

目的 检测酰基辅酶A合成酶中链家族成员3(ACSM3)、微小RNA-653-5p(miR-653-5p)在前列腺癌组织中的表达,并探讨两者与患者临床病理特征及预后的关系。方法 收集2016年4月至2018年4月成都医学院第一附属医院收治的150例行前列腺癌根治术患者的前列腺癌组织标本、癌旁组织标本作为研究对象。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测前列腺癌组织、癌旁组织中ACSM3 mRNA、miR-653-5p的表达水平;分析前列腺癌组织中ACSM3 mRNA、miR-653-5p水平与患者临床病理特征的关系;采用Kaplan-Meier生存曲线分析前列腺癌组织中ACSM3、miR-653-5p表达水平与患者预后的关系。结果 与癌旁组织相比,前列腺癌组织中ACSM3 mRNA水平显著降低,miR-653-5p水平显著升高(P<0.05);Gleason评分≥8分、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、分化程度为未-低分化、有淋巴结转移的前列腺癌患者的前列腺癌组织中ACSM3 mRNA水平均低于Gleason评分<8分、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期、分化程度为中-高分化、无淋巴结转移的前列腺癌患者,而miR-653-5p水平均高于Gleason评分<8分、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期、分化程度为中-高分化、无淋巴结转移的前列腺癌患者(P<0.05);ACSM3 mRNA低表达患者3年总体生存率(60.49%)低于ACSM3 mRNA高表达患者(85.51%)(χ^(2)=11.564,P<0.05);miR-653-5p低表达患者3年总体生存率(80.56%)高于miR-653-5p高表达患者(64.10%)(χ^(2)=5.027,P<0.05)。结论 前列腺癌组织中ACSM3表达降低,miR-653-5p表达升高,两者表达水平与患者的临床病理特征关系密切,且能预测患者术后3年的生存情况。

酰基辅酶A合成酶长链家族成员4介导的脂质过氧化导致乳腺癌细胞发生铁死亡

目的探讨酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)的敲除和过表达对乳腺癌细胞MBA-MD-231细胞发生铁死亡的影响。方法用CRISPR-Cas9技术敲除ACSL4,PLVX-puro质粒过表达ACSL4;用MTT实验检测铁死亡诱导剂处理WT、ACSL4-KO和ACSL4-OE细胞后的生存率;用流式分析技术检测铁死亡诱导剂RSL3处理细胞后脂质过氧化物的变化;用脂质氧化试剂盒检测铁死亡诱导剂RSL3处理细胞后丙二醛(MDA)变化。结果与WT细胞相比,ACSL4-KO细胞对铁死亡诱导剂的抗性增加,ACSL4-OE细胞对铁死亡诱导剂的敏感性增加;铁死亡诱导剂RSL3处理后,ACSL4-KO细胞脂质过氧化物含量低于ACSL4-OE细胞,ACSL4-KO细胞MDA含量低于WT细胞,ACSL4-OE细胞MDA含量高于WT细胞。结论ACSL4的敲除和过表达会改变MDA-MB-231细胞对铁死亡诱导剂的敏感性,ACSL4可能作为乳腺癌细胞铁死亡的关键因子。

前列腺癌组织中ACSS3、PIM1表达变化及其与患者预后的关系

目的 探讨前列腺癌(PC)组织中酰基辅酶A合成酶短链家族成员3(ACSS3)、丝氨酸/苏氨酸激酶1(PIM1)表达变化及其与患者预后的关系。方法 选择行根治手术治疗的PC患者82例,术中留取癌组织和癌旁组织,采用免疫组化法检测ACSS3、PIM1。比较癌组织与癌旁组织ACSS3、PIM1阳性率,比较不同临床病理特征PC患者癌组织ACSS3、PIM1阳性率。术后随访3年,记录患者肿瘤进展情况,比较ACSS3、PIM1阳性与阴性患者的3年无进展生存率;采用多因素Logistic回归分析影响PC患者术后肿瘤进展的因素。结果 PC癌组织ACSS3阳性率低于癌旁组织,PIM1阳性率高于癌旁组织(P均<0.01)。与Gleason评分≤7分、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期的PC患者比较,Gleason评分>7分、TNM分期Ⅲ期的PC患者ACSS3阳性率降低,PIM1阳性率升高(P均<0.05)。术后3年患者肿瘤进展22例,无进展60例,3年无进展生存率为73.17%。ACSS3阳性患者3年无进展生存率高于阴性患者,PIM1阳性患者3年无进展生存率低于阴性患者(P均<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,TNM分期、术前PSA水平、Gleason评分、手术切缘阳性、ACSS3及PIM1是影响PC患者肿瘤无进展生存预后的独立因素。结论 PC组织中ACSS3表达降低、PIM1表达升高,二者与PC患者术后肿瘤进展有关。

利用TCGA和GEPIA2公共数据库分析ACSM3与卵巢癌预后的关系

目的 研究肿瘤基因图谱(TCGA)数据库中酰基辅酶A合成酶中链家族成员3(ACSM3)在357例卵巢癌患者中的表达量及其与患者生存状况的关系。方法 对TCGA数据库中357例卵巢癌患者的ACSM3表达量及其与生存情况的关系进行分析,寻找其共表达基因并进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。结果 多因素Cox回归分析进一步表明,ACSM3是卵巢癌患者预后的影响因素,其共表达基因富集分析结果与炎症应答和肿瘤中基因异常转录相关。结论 ACSM3的表达对卵巢癌患者的预后具有重要的意义,高表达预后较好。ACSM3可以成为指导临床医师评估卵巢癌患者预后的重要指标。

铁死亡在结直肠癌再生细胞放疗抵抗中的作用及其可能的机制

目的:探讨铁死亡在结直肠肿瘤再生细胞放疗抵抗中的功能和机制。方法:采用二维常规条件培养结肠癌HCT116细胞(Control细胞),同时通过机械力方法在三维纤维蛋白软胶中培养并筛选出具有高致瘤能力的肿瘤再生细胞(TRC);用不同剂量(2、4、6、8 Gy)的X-射线照射Control细胞和TRC,并通过MTS、细胞克隆实验分别检测各组细胞的存活率和增殖能力;Control细胞和TRC在采用铁死亡诱导剂(Erastin)和X-射线分别处理后,用C11-BODIPY试剂进行染色,通过共聚焦显微镜和流式细胞术观察并测定细胞的脂质过氧化水平。用qPCR法检测X-射线照射、Erastin处理对Control细胞和TRC中铁死亡相关基因谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和酰基辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)表达的影响,用WB法检测对细胞中铁死亡相关蛋白GPX4、ACSL4表达的影响。结果:从纤维蛋白软胶中培养并筛选出高干性的TRC;用不同剂量(2、4、6、8 Gy)的X-射线照射后,Control细胞存活率较TRC显著降低(P<0.05),且Control细胞的克隆大小和数量较TRC显著降低(均P<0.05);Control细胞采用不同剂量X-射线(4、8 Gy)照射及用Erastin处理后,X-射线处理组细胞脂质过氧化水平较未处理组细胞显著升高(P<0.05),Erastin处理组细胞脂质过氧化水平较DMSO处理组细胞显著升高(P<0.05),而TRC各处理组间无显著差异(均P>0.05)。机制研究发现,TRC中GPX4和ACSL4在铁死亡诱导条件(X-射线照射或Erastin处理)下较Control细胞呈现出有助于抵抗的表达模式,即GPX4持续上调、ACSL4持续下调,且表现为Erastin剂量依赖性。结论:结直肠TRC可能通过高表达GPX4、低表达ACSL4来抵抗铁死亡,从而抵抗放疗。

铁死亡抑制剂预培养的大鼠心肌细胞抵抗素诱导后细胞肥大程度及铁死亡相关蛋白表达观察

目的观察铁死亡抑制剂Fer-1预培养的大鼠心肌细胞系H9c2抵抗素诱导后细胞肥大程度及铁死亡相关蛋白的表达情况。方法将H9c2细胞饥饿培养16 h,随机分为1、2、3、4组。1组用含1μmmol/L的Fer-1的培养基培养16 h,后换为含50 ng/mL抵抗素的培养基培养32 h;2组用含1μmmol/L的Fer-1培养基培养16 h,后换为0.1%FBS培养基培养32 h;3组用含50 ng/mL抵抗素的培养基培养48 h;4组(正常对照组)用0.1%FBS培养基培养48 h。取各组细胞,采用Image J软件测量细胞表面积,采用BCA法测算单细胞蛋白含量,采用RT-qPCR法检测心肌细胞肥大相关胚胎基因ANP、BNP和β-MHC;采用WESTERN Blotting法检测各组铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(Acyl-CoA synthetase long-chain family member,ACSL4)及环氧合酶2(COX2)。结果与4组比较,3组H9c2细胞表面积增大,单细胞蛋白含量高,ANF、BNF及β-MHC基因相对表达量高,GPX4蛋白相对表达量低、ACSL4及COX2蛋白相对表达量高(P均<0.05)。与3组相比,1组细胞表面积小,单细胞蛋白含量低,ANF、BNF及β-MHC基因相对表达量低(P均<0.05);与3组相比,1组细胞GPX4蛋白相对表达量高、ACSL4及COX2蛋白相对表达量低(P均<0.05)。结论Fer-1能抑制抵抗素诱导的H9c2细胞肥大。Fer-1可能通过促进铁死亡相关蛋白GPX4表达、抑制ACSL4及COX2蛋白表达,抑制抵抗素诱导的H9c2肥大。

解毒活血汤调控YAP/ACSL4通路抑制铁死亡治疗急性肾损伤的作用与机制研究

解毒活血汤出自王清任《医林改错》,是国医大师张琪教授根据急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)热毒瘀滞病机从古方中筛选出应用临床数十年的有效方剂,该文拟从调控铁死亡(ferroptosis)角度阐释解毒活血汤对AKI的治疗作用及其潜在机制。将32只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:正常组、模型组及解毒活血汤低、高剂量组,每组8只。由于临床AKI的治疗普遍以支持或替代疗法为主,尚无特效药,故该实验未设置阳性药物组。解毒活血汤低剂量组对应0.5倍的临床等效剂量,高剂量组则对应临床等效剂量,予以每日晨间灌胃,连续干预7 d;正常组及模型组小鼠分别灌以相应体积的纯水。给药第5天时,除正常组外其余各组小鼠均按20 mg·kg^(-1)的剂量腹腔注射顺铂溶液进行造模,正常组给予生理盐水注射。造模72 h后取材,留取小鼠血清及肾脏组织,检测血清肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平以评价小鼠肾脏功能变化;酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血清肾损伤分子1(kidney injury molecule 1,KIM-1)的表达水平;苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察小鼠肾组织病理学改变;过碘酸雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色法观察肾脏糖原沉积变化;普鲁士蓝染色观察肾组织铁沉积水平;生化比色法检测肾组织中还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)以及过氧化氢酶(catalase,CAT)活力。采用Wes-tern blot法检测小鼠肾组织中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)及Hippo通路关键分子Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)蛋白表达;免疫组化法检测YAP在肾组织中的定位与相对表达;再采用实时荧光定量PCR法检测ACSL4及谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)mRNA表达。结果显示,与正常组相比,顺铂诱导的AKI小鼠血清中Scr、BUN、KIM-1水平显著升高;肾组织病理显示,模型组小鼠肾小管上皮细胞发生显著萎缩坏死脱落,肾小管刷状缘消失,管内大量蛋白管型填充,小管空泡样变性,肾间质增宽且可见水肿,肾脏结构严重损伤,肾小管损伤评分显著升高;肾组织部分区域有明显的铁沉积;肾组织GSH含量、SOD及CAT活力显著降低;同时,肾组织中铁死亡标志分子ASCL4、LPCAT3显著升高,GPX4显著降低,YAP显著上调。与模型组相比,高剂量解毒活血汤可有效保护肾脏功能,降低Scr、BUN、KIM-1水平,减轻肾脏病理损伤及糖原沉积和铁沉积;提升肾组织中GSH含量、SOD及CAT活力。进一步的机制研究表明,解毒活血汤组ACSL4、LPCAT3及YAP蛋白表达较模型组显著降低,而GPX4水平显著升高。综上,解毒活血汤可以通过调控YAP/ACSL4信号通路抑制铁死亡,对顺铂诱导的AKI发挥保护作用。

采用基因表达谱芯片技术研究锌α2糖蛋白对肥胖小鼠肝脏基因表达的影响

目的采用基因芯片技术研究锌α2糖蛋白（ZAG）对肥胖小鼠肝脏基因表达谱的影响。方法通过高脂饮食诱导建立肥胖ICR小鼠模型，将21只成模小鼠以随机数字表法分为ZAG干预组（n=8）和高脂饮食组（HFD组，n=13），另取空白对照ICR大鼠10只作为普通饮食组（SF组，n=10）。给予ZAG组小鼠腹腔注射ZAG表达质粒干预及高脂饮食喂养，HFD组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水及高脂饮食喂养，SF组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水及普通饲料喂养。干预8周后，测定各组小鼠血糖、血脂、胰岛素水平等生化指标。用基因组表达谱芯片观察ZAG组和HFD组小鼠肝脏组织基因表达谱，尤其是糖脂代谢相关基因表达的变化，并用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法进一步对部分差异基因表达进行验证。两样本均值的比较用独立样本的t检验。结果干预8周后，ZAG组小鼠的体重、体脂和空腹血糖水平均较HFD组分别降低了14．5％、57．17％和35．5％，3组间差异有统计学意义（F=7．948、18．941、4．327，均P〈0．05）。基因芯片技术发现ZAG干预后，肥胖小鼠的肝脏组织中共有424个基因表达发生了变化，其中上调基因299个，下调基因125个。与糖脂代谢相关的基因共有6个：烯酰辅酶A（Ehhadh）、3-酮脂酰基CoA硫解酶1（ACAA1）、长链酰基辅酶A合成酶家族成员1（ACSL1）、葡萄糖6磷酸酶（G6P）、过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1α（PGC-1α）和细胞因子信号抑制因子（SOCS3）。其中PGC-1α和SOCS3基因的表达分别升高到HFD组的1．97和4．15倍；而Ehhadh、ACAA1、ACSL1、G6P等基因的表达均下调，分别为HFD组的0．35、0．58、0．52和0．33倍。实时荧光定量PCR验证部分基因，结果与基因芯片的检测结果一致。结论ZAG可显著改善肥胖小鼠的糖脂代谢，可能与其抑制肝脏组织ACSL1和G6P表达、促进PGC-1α和GYS2表达有关。