3′RACE法扩增谷氨酰胺合成酶基因及其生物信息学分析

以抽提得到的黑曲霉mRNA为模板,根据GenBank上检索的谷氨酰胺合成酶基因mRNA序列,设计特异性引物,进行3′RACE PCR扩增,并在NCBI网站进行生物信息学分析。结果扩增得到长约1kb的DNA片段,测序结果表明,所获得的DNA序列与gene bank上检索到黑曲霉产谷氨酰胺合成酶基因的同源性大于97%,与其他曲霉产谷氨酰胺合成酶的基因同源性大于50%。经开放阅读框软件分析发现其具有2个外显子,其中1个外显子的氨基酸序列与黑曲霉产GS同源性为100%。

转BpGH3.5基因白桦优良株系选择

【目的】植物生长素酰胺合成酶基因家族(GH3s)为典型的植物生长素初级/早期响应基因,多数家族基因可通过调节植物体内游离IAA的浓度实现对生长发育的调控。故此,采用基因工程育种技术将BpGH3.5正义链、反义链导入白桦基因组中,预期获得速生转基因白桦新品种。【方法】以7年生白桦转BpGH3.5基因的54个正、反义链株系及对照(WT)株系为研究对象,测定树高、胸径及材积等生长指标,采用PCR及qRT-PCR技术分别检测转正、反义链各5个株系目标基因的遗传稳定性及相对表达量,同时采用ELISA技术测定游离IAA含量。【结果】PCR扩增显示,转基因株系中的nptⅡ外源基因均为阳性;qRT-PCR分析显示,5个转正义链株系中BpGH3.5基因表达量均显著高于WT株系,相反,5个转反义链株系中内源BpGH3.5基因表达量均显著下调,即BpGH3.5反义链导入白桦基因组后干扰了白桦BpGH3.5基因的表达。内源游离IAA含量测定显示,转BpGH3.5正义链株系的IAA含量低于或显著低于WT株系,5个转反义链株系均显著高于WT株系(P <0.01),其IAA含量均值高于WT株系的52.26%。7年生转BpGH3.5白桦的树高、胸径及材积生长性状在株系间的差异达到了极显著水平(P <0.01),在树高、胸径及材积生长指标高于群体均值的转基因株系中,转反义链株系占80%以上,认为BpGH3.5反义链导入白桦基因组中通过抑制BpGH3.5基因的表达,削弱IAA氨基酸化的能力,进而释放更多游离IAA从而促进白桦的生长。采用主成分分析法,选出10个速生的转反义链株系,这些株系的树高、胸径及材积均值较群体均值分别高8.55%、19.28%、50.42%,材积的平均遗传增益为36.3%。上述入选株系为后续转BpGH3.5白桦的环境释放提供参考。【结论】BpGH3.5反义链导入白桦基因组中,能够抑制BpGH3.5基因的表达,同时释放更多游离IAA而促进白桦的生长,采用主成分分析法,选出10个优良株系。

甘蔗ScGH3.8基因的克隆、表达及蛋白纯化

Gretchen hagen 3(GH3)基因编码酰基酰胺合成酶,属于植物生长素早期响应基因,通过催化生长素和茉莉酸等激素与氨基酸的偶联反应,使激素失活或激活来维持植物体内激素的动态平衡,从而调节植物生长发育和抵抗逆境胁迫。本研究采用RT-PCR克隆甘蔗(Saccharum officinarum)GH3基因,获得长1 776 bp具有完整开放阅读框的基因序列,命名为ScGH3.8。生物信息学分析表明,ScGH3.8基因编码591个氨基酸,具有GH3高度保守结构域、无跨膜结构和信号肽,亚细胞定位于细胞质,属酸性蛋白。系统进化分析表明,ScGH3.8与南荻(Miscanthus lutarioriparius)、高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)的GH3进化关系最近,属于同一进化分支。逆境胁迫表达分析表明,ScGH3.8同源基因Sspon.03G0024250-1A、Sspon.03G0024250-2C、Sspon.03G0024250-3D、Sspon.03G0037250-1B受干旱和甘蔗花叶病毒胁迫诱导表达;Sspon.03G0024250-1A受甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)胁迫诱导表达。通过构建pRSF-ScGH3.8原核表达载体,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株并诱导表达,发现重组蛋白最佳表达条件为37℃, 0.5 mmol/L的IPTG诱导2 h。利用亲和层析法对重组蛋白进行纯化获得ScGH3.8蛋白,相对分子质量为64.59 kDa。这些结果为进一步探究ScGH3.8基因在甘蔗发育和抗逆性中的功能提供理论参考和数据支持。