N-酰基高丝氨酸内酯酶在肉鸡中应用的耐受性评价

本试验依据《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南(试行)》对N-酰基高丝氨酸内酯酶(AHLase)在肉鸡中的应用进行耐受性评价。采用双因素试验设计,选取健康、体重接近的1日龄科宝肉仔鸡360只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复20只鸡,公母各占1/2且分笼饲养。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加500(AHLase-500)和5000 mg/kg(AHLase-5000)的AHLase。试验期42 d。结果表明:1)与对照组相比,AHLase-5000组公鸡1~21日龄的平均日采食量显著提高(P<0.05),22~42日龄以及1~42日龄的料重比显著降低(P<0.05);AHLase-5000组母鸡22~42日龄末重显著提高(P<0.05),而AHLase-500、AHLase-5000组1~42日龄母鸡的平均日采食量显著降低(P<0.05)。2)试验期内公鸡的平均日增重、平均日采食量显著高于母鸡(P<0.05)。1~21日龄公鸡的料重比有高于母鸡的趋势(P=0.075)。性别对1~21日龄肉鸡末重表现出趋于显著的影响(P=0.079)。3)随着AHLase添加水平的增加,1~21日龄肉鸡的平均日采食量显著提高(P<0.05),平均日增重有提高的趋势(P=0.052),而料重比显著降低(P<0.05);22~42日龄肉鸡的末重显著提高(P<0.05)。4)AHLase添加水平和性别在1~21日龄平均日采食量、22~42日龄平均日采食量以及1~42日龄料重比中均表现出显著互作效应(P<0.05);在22~42日龄料重比(P=0.069)以及1~42日龄平均日增重(P=0.064)中表现出互作趋势。5)饲粮中添加AHLase对肉鸡血常规和血清生化指标无显著影响(P>0.05)。6)饲粮中添加AHLase对肉鸡器官指数无显著影响(P>0.05),组织未观察到形态结构变化。由此可见,饲粮中添加5000 mg/kg的AHLase改善了肉鸡生长性能,对血液生理生化指标和内脏器官发育无显著影响,表明肉鸡对AHLase的耐受剂量在5000 mg/kg以上。

一株降解N-酰基高丝氨酸内酯酵母菌菌株的分离鉴定及其降解特性

利用N酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,简称AHL)为唯一碳源和能源,筛选得到一株能够降解AHL的菌株R1。常规鉴定和18S rDNA序列分析表明,菌株R1属于红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides),定名为R.toruloidesR1。结果显示R.toruloidesR1能利用所测试的3种AHL作为唯一碳源和能源生长,具有降解AHL的能力,其对AHL依赖型胡萝卜欧文氏软腐病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)的致病有一定的抑制作用。

气相色谱-质谱法检测细菌中N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子

建立了N-酰基高丝氨酸内酯类(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)群体感应信号分子的气相色谱-质谱(GC-MS)检测方法,并优化了检测条件。在优化条件下,采用选择离子扫描模式(SIM)从细菌Pseud-oalteromonas sp.NJ6-3-1培养液中检测到3种AHLs(N-己基高丝氨酸内酯(C6-HSL)、N-辛基高丝氨酸内酯(C8-HSL)和N-十四基高丝氨酸内酯(C14-HSL))。与传统的薄层层析-生物传感器(TLC-biosensor)和高效液相色谱法(HPLC)相比,该方法更加简单、高效,只需对培养液样品进行简单处理,即可定性检测样品中的AHLs分子。该方法为从复杂基质中检测和鉴定AHLs信号分子提供了有效手段。

N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉仔鸡生长性能、屠宰性能和养分表观代谢率的影响

本试验旨在研究N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉仔鸡生长性能、屠宰性能和养分表观代谢率的影响。选取健康、体重接近的1日龄科宝肉仔鸡600只,随机分为5组,每组6个重复,每个重复20只鸡,公母各占1/2且分笼饲养。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加250、500、750、1 000 mg/kg的N-酰基高丝氨酸内酯酶。试验期42 d。结果表明:1)与对照组相比,饲粮中添加500 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶可以显著提高1~21日龄公鸡的平均日采食量(P<0.05),添加500、750 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶显著降低母鸡的料重比(P<0.05)。公鸡的平均日增重、平均日采食量和料重比均显著高于母鸡(P<0.05)。随着N-酰基高丝氨酸内酯酶添加水平的增加,肉鸡的平均日增重有提高趋势(0.05<P<0.10),料重比显著降低(P<0.05)。N-酰基高丝氨酸内酯酶添加水平和性别对料重比有显著互作效应(P<0.05)。2)与对照组相比,添加500、750、1 000 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶能显著降低22~42日龄公鸡的平均日采食量和料重比(P<0.05),母鸡的料重比有降低趋势(0.05<P<0.10)。公鸡的平均日增重、平均日采食量均显著高于母鸡(P<0.05),而料重比显著低于母鸡(P<0.05)。随着N-酰基高丝氨酸内酯酶添加水平的提高,肉鸡的平均日采食量有降低的趋势(0.05<P<0.10),而料重比显著降低(P<0.05)。3)与对照组相比,添加1 000 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶可以显著降低1~42日龄公鸡和母鸡的平均日采食量和料重比(P<0.05)。公鸡的平均日增重、平均日采食量均显著高于母鸡(P<0.05),而料重比显著低于母鸡(P<0.05)。随着N-酰基高丝氨酸内酯酶添加水平的提高,肉鸡的平均日采食量和料重比显著降低(P<0.05)。4)与对照组相比,添加500、750、1 000 mg/kg N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高肉鸡的屠宰率、全净膛率、半净膛率和胸肌率(P<0.05),显著降低腹脂率(P<0.05)。5)与对照组相比,N-酰基高丝氨酸内酯酶对干物质、粗蛋白质和能量表观代谢率有显著影响(P<0.05)。由此可见,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著改善了不同性别科宝肉仔鸡的生长性能、屠宰性能和养分表观代谢率。其中,添加500 mg/kg的N-酰基高丝氨酸内酯酶的效果最佳。

N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉仔鸡血清生化、免疫指标以及肠道形态的影响

本试验旨在研究N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉仔鸡血清生化、免疫指标和肠道形态的影响。选取1日龄健康、体重相近的科宝肉仔鸡600只,随机分为5组,每组6个重复,每个重复20只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加250、500、750和1000 mg/kg的N-酰基高丝氨酸内酯酶。试验期42 d。结果表明:1)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高21和42日龄肉鸡血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白和尿酸含量,以及21日龄血清尿素氮含量(P<0.05)。2)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高21日龄肉鸡血清中碱性磷酸酶活性(P<0.05)。3)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高21日龄肉鸡血清中脂蛋白含量,以及42日龄血清脂蛋白和胆固醇含量(P<0.05)。4)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高21和42日龄肉鸡血清中免疫球蛋白A和免疫球蛋白M含量(P<0.05)。5)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高肉鸡的胰腺指数(P<0.05)。6)与对照组相比,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶显著提高肉鸡十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度和绒隐比(P<0.05),显著降低回肠隐窝深度(P<0.05)。综上所述,饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶促进蛋白质和脂质在肉鸡体内的代谢和周转,并改善了肠道形态,其中添加500 mg/kg的N-酰基高丝氨酸内酯酶对肉鸡健康和生长的效果最佳。

细菌群体感应信号分子N-酰基高丝氨酸内酯的检测

群体感应是细菌生长到一定密度时相互感应,并进行基因表达及调控产生的独特、多样的群体行为现象。N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)类化合物是革兰阴性菌群体感应中最重要的一类信号分子,调控许多生理特性基因的表达。快速、简便、有效地检测细菌能否产生AHL或产生何种信号分子,成为深入研究和了解细菌群体感应的重要手段。我们就细菌群体感应信号分子AHL检测的基本原理和方法及国内外研究进展进行了总结。

拟南芥响应3-羰基己酰基高丝氨酸内酯的膜蛋白质组分析

为了探索植物响应细菌信号N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的分子机制。本文利用二维差异凝胶电泳技术分析了3-羰基己酰基高丝氨酸内酯(3OC6-HSL)处理引起拟南芥膜蛋白质组的变化情况,结果表明3OC6-HSL共诱导53个蛋白点发生显著变化,涉及天然免疫、逆境胁迫响应、碳代谢、能量代谢、光合作用等多种生物学功能,暗示了3OC6-HSL在调控植物生长发育和抗逆性方面发挥着重要作用,可为阐明植物-细菌跨界通讯的分子机制提供更多的功能蛋白质信息。

红球菌来源QsdA型N-酰基高丝氨酸内酯酶水产养殖饲用潜力分析

通过研究Qsd A型N-酰基高丝氨酸内酯酶酶学性质来评估其饲用潜力。研究通过提取红球菌(Rhodococcus erythropolis)BLJF-1的基因组,利用PCR技术克隆得到N-酰基高丝氨酸内酯酶基因qsd Arh5。构建重组表达载体p ET28a/qsd A-rh5转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选得到具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的转化子即为重组菌株,随后经Ni-NTA柱纯化得到的重组蛋白Qsd A-RH5进行补充酶学性质的研究。结果表明,克隆得到972 bp的目的基因。构建重组载体,筛选得到重组菌株经诱导表达后得到具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的目的蛋白即Qsd A-RH5,经分析表明,该蛋白的理论分子量为36 k D,属于金属依赖性水解酶PET超家族。酶学性质研究表明:其最适作用p H为8.0,作用温度为35℃,在p H 6—11内能够稳定的存在,在10—40℃,酶活性能够维持在80%以上,且该酶对多种金属离子、化合物具有很好的抗性。该融合蛋白具有较为专一的底物特异性,只对没有取代基团的底物具有水解作用,以C7-HSL为底物时的Km值为0.0125 mmol/L。实验经酶学性质研究表明,该酶具有较为专一的底物特异性,因此可具有针对性的控制外源性病原菌毒性效应对维护畜禽(水产)消化道健康方面具有一定的应用前景。

蜡质芽孢杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及序列分析

利用pMD18-T克隆载体从蜡质芽孢杆菌菌株T-HW 3中克隆了酰基高丝氨酸内酯酶基因(AHL-lactonase,aiiA)。测序结果表明,该基因(GenBank登录号为DQ000643)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质的推测的分子量为28kDa,等电点为4.235左右。核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为蜡质芽孢杆菌组aiiA基因(86%-99%)。

拟南芥GCR2参与感应N-丁酰基高丝氨酸内酯过程的初步研究

N-丁酰基高丝氨酸内酯(C4-HSL)是革兰氏阴性菌主要的群体感应信号,其能促进植物生长发育,激活细胞膜表面的Ca2+通道,从而参与调控植物的生理代谢。然而,植物感应C4-HSL的分子机制并不清楚。拟南芥GCR2作为ABA的受体,对植物的生理代谢十分重要。旨在探寻GCR2是否参与拟南芥感应C4-HSL的过程。q RT-PCR结果表明,C4-HSL处理后1 h,GCR2基因表达量出现明显上调并在6 h后达到最大值,说明C4-HSL可调节GCR2。ELISA结果显示,GCR2蛋白表达量也在6 h达到最大值。对体外表达的GCR2进行纯化和浓缩,使其达到0.6 mg/m L后进行微量热泳动(MST)检测。MST测得C4-HSL与GCR2的解离常数(Kd)为166 nmol/L,显示出较强的结合能力。用BSA作为阴性对照,表明C4-HSL与GCR2的结合具有一定的特异性。这些结果表明GCR2可能参与了拟南芥感应C4-HSL的过程。

苏云金芽胞杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及分析

利用pMD18-T克隆载体从苏云金芽胞杆菌菌株WB12中克隆了酰基高丝氨酸内酯酶基因(AHL-lactonase,aiiA).测序结果表明,该基因(GenBank登录号为DQ000642)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质.推测该蛋白质分子质量为28 ku,等电点为4.2,不含信号肽序列.利用DNAMAN软件构建同源关系树.结果表明,该蛋白与已报道具有减弱欧文氏菌胡萝卜亚种致病力的11个A iiA蛋白酶氨基酸序列总相似性为81.2%,并含有相同的氨基酸序列保守区.核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为蜡质芽孢杆菌组aiiA基因(86%-99%).

细菌群体感应信号分子——酰基高丝氨酸内酯的检测

革兰氏阴性菌根据信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的浓度可以监测周围环境中自身或其他细菌的数量变化,当信号分子达到一定浓度阈值时,能启动相关基因的表达来适应环境的变化,这一调控系统被称为细菌的群体感应(quorumsensing,QS)系统。快速简便而有效地检测细菌是否以及产生何种信号分子成为深入研究和了解细菌群体感应的重要手段。现对信号分子AHLs敏感的用于检测不同的信号分子AHLs的微生物传感菌进行综述,并对其检测能力进行了讨论。

酰基高丝氨酸内酯类化合物诱导细菌NJ6-3-1抗菌物质代谢的研究

目的选择一株具有抗菌活性的海绵共栖细菌NJ6-3-1为实验菌株,考察其抗菌物质的代谢是否受到群体感应诱导信号分子的调控。方法利用细菌NJ6-3-1自身代谢的3种酰基高丝氨酸内酯类化合物(Acyl-homoserine lac-tones,AHLs)作为自诱导物质,采用生物自显影和高效液相色谱技术,研究了低密度条件下的细菌NJ6-3-1与3种不同AHLs共培养时的抗菌活性及抗菌物质代谢情况。结果辛酰基高丝氨酸内酯(C8-HSL)能诱导细菌NJ6-3-1在不产生抗菌物质的低密度生长条件下代谢抗菌物质,并且能诱导细菌NJ6-3-1抗菌物质代谢产量显著增强。结论细菌NJ6-3-1抗菌物质的代谢受到自诱导物C8-HSL的调控。

N-酰基高丝氨酸内酯酶对断奶仔猪生产性能的影响

为研究新型生物饲料添加剂N-酰基高丝氨酸内酯酶对断奶仔猪生产性能的影响,本试验采用单因素随机设计,选择健康,胎次、体重接近的"杜×长×大"断奶仔猪168头,随机分成3组,每组4个重复,每个重复14头猪,试验期35 d。对照组饲喂基础日粮,试验组分别在基础日粮中添加100 g/t葡萄糖氧化酶和500 g/t N-酰基高丝氨酸内酯酶。试验结果表明:与对照组相比,葡萄糖氧化酶组和N-酰基高丝氨酸内酯酶组断奶仔猪日增重均提高11.76%(P<0.05),料肉比分别降低9.28%和8.25%(P<0.05),腹泻率分别降低7.20%和24.80%(P<0.05)。各试验组间皮毛指数差异不显著(P>0.05)。由此可见,N-酰基高丝氨酸内酯酶可改善仔猪的生产性能,降低仔猪腹泻率。

酰基高丝氨酸内酯——细菌与真核生物之间信息交流的介导分子

许多革兰氏阴性细菌利用酰基高丝氨酸内酯(AHLs)作为胞间信号分子协调细菌群体基因的表达,这一AHLs介导的细菌群体感应系统参与细菌多种生理行为和生物学功能的调控．近年来人们研究发现细菌AHLs也能够影响真核基因的表达,真核生物反过来也可能会通过产生AHL类似物或AHL信号通路中的激活剂或拮抗剂与细菌群体感应系统发生相互作用,意味着细菌和真核生物利用酰基高丝氨酸内酯进行某种形式的信息交流．文中介绍了上述各方面的研究进展．

N-乙酰基高丝氨酸内酯调节细菌与植物间互作的研究进展

植物促生菌具有抗病和促生的潜能,在农业生产及环境保护方面都具有重要的作用。在许多革兰氏阴性细菌中,N-乙酰基高丝氨酸内酯(AHLs)介导的群体感应(QS)系统不仅参与对细菌多种生理行为和生物学功能的调控,而且影响植物基因的表达及细菌与宿主植物间的互作。为了更好地开发利用生防菌,综述了多年来对AHLs跨界信号转导参与调节植物生长发育和抗逆性的研究,并对该领域今后的研究方向进行了展望,以期为改善植物抗逆性和促进生长提供一些新思路。

N-酰基高丝氨酸内酯半抗原衍生物及其全抗原的合成与鉴定

目的本研究旨在合成N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHL)全抗原,为建立AHL免疫检测新方法奠定基础。方法以γ-丁内酯和高丝氨酸内酯为原料,经保护、缩合、脱保护、氧化等一系列反应,获得N-丁酰高丝氨酸内酯、N-己酰高丝氨酸内酯和含有化学交联活性基团的羧基丁酰高丝氨酸内酯半抗原衍生物,用核磁共振氢谱和质谱方法进行结构确证,并采用活泼酯法合成N-酰基高丝氨酸内酯全抗原。结果质谱与核磁共振氢谱分析结果与理论预测相同,表明成功合成目标产物N-丁酰(己酰)高丝氨酸内酯和羧基丁酰高丝氨酸内酯半抗原衍生物;紫外吸收光谱扫描结果显示半抗原AHL已分别与载体牛血清白蛋白和鸡卵白蛋白交联,成功制备其全抗原。结论本实验成功合成了N-酰基高丝氨酸内酯半抗原衍生物和全抗原,为制备AHL相应抗体奠定了基础。

N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA的分子改造及酶学特性

革兰氏阴性细菌的群体感应系统利用N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHL)作为主要信号分子诱导致病因子表达,造成细菌性病害.N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AHLase)能水解AHL分子的内酯键,减弱致病菌的危害.本研究利用从苏云金芽孢杆菌克隆的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(auto inducer inactivation A,aiiA),根据Swiss-model模拟aiiA所编码的AiiA蛋白三维结构,预测可能形成的分子内盐桥、活性中心位点等,利用环状诱变方法对AiiA进行定点突变,以期提高其酶活力和热稳定性等酶学性能.对AiiA及其突变蛋白酶学特性分析结果发现,突变体AiiA-N65K-A206E酶活力要比野生型AiiA-wild提高87.4%,并表现出良好的热稳定性和储存稳定性;37℃温浴30 min后酶活力剩余73.9%,比AiiA-wild有了大幅提高;4℃储存120 h后酶活力剩余12.9%,而AiiA-wild丧失酶活力.酶动力学分析表明,AiiA-N65KA206E酶促反应的米氏常数Km为1.23 mmol/L,与野生型相当;最大反应速率Vmax为32.36μmol/L/min,比野生型有较大提高.本研究表明,利用定点突变技术改造AiiA的分子结构,可有效提升AiiA酶活力、热稳定性和储存稳定性.本研究结果为进一步阐明AiiA结构与功能的关系,促进AiiA在植物病害生物防治上的应用,提供了有益的参考和新的思路.

SPE前处理-UHPLC-MS/MS测定MBR中两种N-酰基高丝氨酸内酯

选用N-己基高丝氨酸内酯(C6-HSL)和N-辛基高丝氨酸内酯(C8-HSL)两种酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)为代表物,建立了固相萃取(SPE)-超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UHPLC-MS/MS)分析膜生物反应器(MBR)活性污泥中AHLs的方法.研究结果表明C6-HSL和C8-HSL在1～200μg/L内有良好的线性关系(R2> 0.998),方法的检出限为0.100μg/L,定量限为1.000μg/L,在3个浓度水平下的平均加标回收率为80.69%～83.75%,相对标准偏差(RSD)为4.71%～7.25%.方法精确度高、重复性好、基质效应弱,适用于MBR活性污泥中痕量AHLs的测定.

超高效液相色谱-串联质谱法检测微氧生物脱氮菌群酰基高丝氨酸内酯信号分子

为揭示处理低碳氮比废水的微氧活性污泥系统的生物脱氮机制,了解脱氮功能菌群的群体生长和代谢规律,建立了超高效液相色谱-串联质谱同时定量检测介导革兰氏阴性（G-）细菌群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯（ AHLs）的方法。取自升流式微氧活性污泥反应器的泥水混合物,使用乙酸乙酯液液萃取,旋转蒸干后以甲醇定容,经C18色谱柱分离。以5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）和甲醇为流动相进行梯度洗脱,采用多反应离子监测模式,使用配有电喷雾离子源的三重四极杆质谱进行检测。对9种AHLs的检测结果表明,在0.5-100μg/L范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.01-0.5μg/L,回收率为62.5%-118.1%,相对标准偏差为2.9%-12.1%,分析时间为6.5 min。本方法具有快速、准确和精密等特点,可及时反映活性污泥功能菌群的生长状态和代谢活性,对了解生物脱氮系统的生物学机制和废水生物处理系统的运行调控具有重要意义。