N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的快速纯化及性质

通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析及阴离子交换层析等三步 ,有效地从一菌株NO .2 2 6 2中纯化了N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶。结果表明 ,酶活性回收约 2 0 %,纯化了 8 4倍。天然PAGE与SDS PAGE分析表明 ,该酶分子为同源四聚体 ,单体分子量约为 3 5kD。酶催化反应的最适pH为 7 7～ 8 0 ,最适温度为 45℃。以N 氨甲酰 DL 丙氨酸为底物时 ,Km =1 3×1 0 - 3 mol L ,Vmax=0 .3 3mol min。二价金属离子Ni2 + 有激活作用 ,Zn2 + 有明显的抑制作用 ,而Co2 + 对酶活无影响。该酶N 末端 8个氨基酸残基依次为TRQKILAF。

酰胺水解法合成硫代磷酸三(4-氨基苯)酯

实验以对乙酰氨基酚和三氯硫磷为原料,经酯化反应合成硫代磷酸三(4-乙酰氨基苯)酯(TPTAA),讨论了反应介质、缚酸剂种类、对乙酰氨基酚与三氯硫磷的物质的量的配比、缚酸剂用量与组成等因素对TPTAA产率的影响,结果表明:在n(对乙酰氨基酚):n(三乙胺+吡啶):n(三氯硫磷)=3.10:3.80:1、n(三乙胺):n(吡啶)=1:0.02、反应温度35℃、反应时间4h条件下,TPTAA的收率可达到88.04%;再将TPTAA在酸性条件下水解得到硫代磷酸三(4-氨基苯)酯(TPTA),探讨了HCl和CH_3OH用量对产物产率的影响,得到:当n(CH_3OH):n(HCl):n(TPTAA)=2.9:6.0:1,反应温度85℃,反应时间3h时,TPTA的收率95.62%。

抑郁症患者外周血中大麻素受体1和脂肪酸酰胺水解酶的mRNA表达水平及意义

目的探讨抑郁症患者外周血中大麻素受体1(CB1)和脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的mRNA表达水平及意义。方法选择43例未经治疗的抑郁症患者(抑郁组)和43例健康志愿者(健康组),采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RTPCR)技术检测两组患者外周血中CB1和FAAH的mRNA表达水平,观察抑郁症患者与健康人群的CB1和FAAH水平变化;采用汉密尔顿抑郁量表(HAMD)和Stroop色词测试对抑郁症患者的抑郁程度和认知功能进行评估,分析CB1和FAAH表达水平与测试结果的相关性。结果 (1)抑郁症患者的CB1-mRNA、FAAH-mRNA表达水平均明显低于健康组(P<0.05);(2)抑郁症患者的CB1表达水平与HAMD中的体质量变化因子正相关(r=1.021,P=0.001);FAAH表达水平与HAMD中的认知障碍因子负相关(r=-0.065,P=0.023);(3)抑郁症患者FAAH-mRNA表达水平影响患者的注意力和反应能力(P<0.05)。结论 CB1受体可以影响抑郁症患者的能量代谢,FAAH会对抑郁症患者的认知障碍产生影响,提示抑郁症患者外周血CB1-mRNA、FAAH-mRNA表达量与抑郁障碍具有相关性。

Delftia sp.T3-6酰胺水解酶DamH晶体制备及X-射线衍射分析

Dam H是菌株Delftia sp.T3-6产生的具有酯键水解活性的酰胺酶,对其原核表达、纯化、结晶条件及蛋白晶体X-射线衍射条件进行了研究。经过原核表达,采用Ni-NTA亲和层析法和透析法纯化蛋白,成功获得了适合晶体生长的蛋白Dam H。289 K下采用座滴气相扩散法进行晶体筛选和制备,在蛋白浓度为15 mg/m L及含有0.2 mol/L乙酸铵,pH 7.1,21%(W/V)聚乙二醇3350的缓冲液中获得了理想的蛋白晶体。在低温100 K下通过X-射线衍射仪(Rigaku Micro Max-007 HF)收集了晶体衍射数据。晶体衍射分辨率为3.4,空间群为三斜晶系P1,晶胞参数为a=14.1,b=23.9,c=85.7,α=112.6°,β=77.2°,γ=89.1°。结晶条件的优化和晶体制备为Delftia sp.T3-6 Dam H高分辨率晶体制备提供了参考,晶体衍射数据的收集为Dam H三维结构的解析奠定了前期基础,将有助于阐明Dam H的催化机制。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶生产菌的选育

以产N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的恶臭假单胞菌MZ0315为出发菌株,应用紫外和硫酸二乙酯的复合诱变,经底物类似物5-氟尿嘧啶的筛选,获得高产、稳定的优良菌株MF0506。经过发酵培养基优化,诱变株的产酶活力由出发菌株的0.443u/ml提高至0.680u/ml。

脂肪酸酰胺水解酶抑制剂抑制活性的神经网络预测模型

为研究脂肪酸酰胺水解酶(Fatty acid amide hydrolase,FAAH)抑制剂抑制活性(p Ki)定量构效关系(Quantitative structure-activity relationship,QSAR),计算了72种FAAH抑制剂的两类结构参数,一类是拓扑指数,另一类是量化参数.利用最佳变量子集回归的方法,建立了7个参数(e2,m3 2,m3,lg P,SAA,m59,e14)的QSAR模型,该模型经验证具有良好的稳健性和预测能力,以此7个参数为人工神经网络的输入层,设定7∶5∶1的网络结构,所建BP模型的相关系数为0.994.结果表明,拓扑指数联合量化参数能全面表征FAAH抑制剂的分子结构特征,其中e2,m3 2,m3,lg P,SAA,m59,e14与p Ki呈现良好的非线性关系,BP神经网络的预测结果优于多元线性回归方法所得的结果.

N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性

将菌株SS-ori的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(DCase)插入到pMAL-c2X载体中,构建表达产物为麦芽糖结合蛋白(MBP)与DCase融合的重组子。该重组子在E.coliBL21中的表达产物为融合蛋白MBP-DCase(76.4ka),光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的19%。经Amy-lose亲和纯化和Superose12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X的背景,用FactorXa剪切后,可得约41.7ka的MBP和34.7ka的DCase。酶活性检测表明当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸做为底物,A600=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸0.78g。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶基因的克隆与表达

按本室纯化的N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶 (DCase)的N 末端氨基酸序列设计了正向引物 ,并在已报道的不同来源菌株DCase的氨基酸序列同源性分析的基础上 ,设计了反向引物。用菌株No . 2 2 62总DNA为模板 ,经PCR扩增获得长度为约0 9kpb的片段 ,DNA序列分析表明基因全长为 912bp。将该片段插入 pET 3a ,构建成重组子 pET DCase ,并在E coliDH5α中获得表达 ,经SDS PAGE检测 ,表达产物分子量与天然纯DCase相同 ,约为 35kD。

脂肪酸酰胺水解酶抑制剂URB597对人肝癌细胞MHCC97H生长和侵袭的抑制作用及机制研究

目的：观察脂肪酸酰胺水解酶抑制剂URB597对人肝癌高转移细胞MHCC97H细胞生长和侵袭性的抑制作用。方法：不同浓度URB597（1、5、10μmol/L）作用于MHCC97H细胞后不同时间,应用MTT法及流式细胞仪检测该种细胞生长活力及凋亡细胞数目的改变;应用Transwell实验检测该种细胞的运动能力及侵袭能力;应用蛋白质印迹法检测该种细胞内磷酸化Akt（p-Akt）和Akt表达量的变化。结果：上述3种浓度的URB597作用于该种细胞3-7d后,细胞活力明显降低,呈时间及剂量依赖性;10μmol/L URB597作用3-7d可显著增加凋亡细胞数目。URB597作用于细胞48h后,与对照组比较,5、10μmol/L URB597可显著抑制MHCC97H细胞侵袭能力（P〈0.01,P〈0.001）。3种浓度URB597作用于细胞24h后,5、10μmol/L URB597可显著下调细胞内p-Akt水平（P〈0.05,P〈0.01）。结论：URB597对体外生长的人肝癌细胞MHCC97H的生长和侵袭有明显抑制作用,该作用可能与其抑制磷酯酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt信号通路有关。

真养产碱杆菌112R_4的二羧酸单酰胺酰胺水解酶

在一株具有环酰亚胺转化活性的真养产碱杆菌 1 1 2R4 中发现了一种特异性的二羧酸单酰胺酰胺水解酶 (半酰胺酶 ) ,它催化环酰亚胺代谢的第二步反应 ,将二羧酸单酰胺水解为二羧酸和氨。该酶的底物仅限于此代谢途径的第一个酶———酰亚胺酶的产物二羧酸单酰胺 ,而对其它的酰胺类化合物没有明显水解活性。真养产碱杆菌 1 1 2R4 中的半酰胺酶和酰亚胺酶在表达上具有相关性 ,环酰亚胺 (如琥珀酰亚胺 )和二羧酸单酰胺 (如琥珀酰胺酸 )对它们有正调控作用 ,游离氨离子显示出负调控作用 ,琥珀酸则在酶合成和活性两方面均表现出影响作用。对重组大肠杆菌中表达的半酰胺酶粗酶的部分性质进行了研究。钴离子对半酰胺酶的活性表现出促进作用 ,比活力提高到 3.37倍 ,表明半酰胺酶可能是一种金属结合酶。

脂肪酸酰胺水解酶抑制剂URB597诱导人肝癌细胞MHCC97H凋亡的作用及其机制研究

目的:观察脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase,FAAH)抑制剂URB597诱导人肝癌高转移细胞MHCC97H凋亡的作用,并探讨其机制。方法:给予不同浓度(1、5、10μmol/L)URB597与MHCC97H孵育,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用蛋白质印迹技术检测凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)在细胞核中的水平,及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。采用caspase 3试剂盒检测caspase 3的活性变化。结果:(1)不同浓度(1、5、10μmol/L)URB597作用细胞1、4、7d后,凋亡细胞数目明显增加,呈时间-剂量依赖性;(2)不同浓度URB597作用96h后细胞内caspase3活性明显升高,且细胞核中AIF水平显著增加;(3)10μmol/L URB597作用细胞96h后,与对照组相比,Bcl-2水平明显下调,Bax水平明显上调,Bcl-2/Bax比值显著下降。PI3K抑制剂LY294002亦可显著降低Bcl-2/Bax比值,但与10μmol/L URB597作用相比,对Bcl-2/Bax比值的影响程度较低。结论:URB597可通过促进人肝癌细胞凋亡抑制其增殖,该作用与其下调Bcl-2/Bax比值,影响线粒体通透性,诱导caspase依赖和非caspase依赖的细胞凋亡有关,且部分依赖于PI3K/Akt通路。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的固定化工艺

以TJS环氧基树脂作为载体对N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶进行固定化,最佳工艺条件为:1g树脂载体大约对应133U酶液,蛋白质量浓度0.35mg/mL,固定时间15h,温度28℃,pH7.5,固定化酶活达到58.5U。蛋白固定率可达97.4%,酶活回收率达到49.3%,得到的固定化酶使用半衰期达到26批。

脂肪酰胺水解酶催化三联体膦酰化失活的机理:一个模型体系的理论研究(英文)

甲基花生四烯基氟代膦酸酯(MAFP)是脂肪酰胺水解酶(FAAH)的一个抑制剂.FAAH的丝氨酸241(Ser241)-丝氨酸217(Ser217)-赖氨酸142(Lys142)催化三联体被MAFP膦酰化后将导致FAAH失活.本文采用B3LYP/6-311G(d,p)和MP2/6-311G(d,p)方法及一个简化的计算模型体系对这个膦酰化抑制反应进行理论研究.考虑了两种反应途径.PathA涉及FAAH的催化三联体的所有残基,是一个分步的加成-消除过程,形成两性离子的三角双锥中间体,其中第一步反应是决速步骤.在这个反应途径中,Ser217和Lys142对亲核试剂Ser241起到碱催化活化的作用,而Ser217充作Lys142和Ser241之间的桥梁.此外,溶剂中的一个水分子作为Lys142和MAFP间的"氢桥"具有关键的作用,通过给出和接收质子促进了长距离的质子转移.PathB是催化三联体中的残基Lys142被突变为丙氨酸以后的膦酰化反应,也是一个分步过程.水的本体溶剂效应通过极化连续介质模型(PCM)估算.计算结果显示膦酰化反应的PathA是优势途径,在水溶液中其决速步骤的活化能垒为64.9kJ·mol-1.FAAH催化三联体中残基Lys142的变异会降低膦酰化反应的速率,这与实验结果相一致.

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶研究进展

用生物转化法生产D 氨基酸已经成为国内外半合成抗生素行业的支柱之一。此外 ,D 氨基酸及其衍生物还是甜味剂、拟除虫菊脂、多肽激素等诸多产品的重要中间体。介绍D 氨基酸生物转化中N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶的一些生化性质。

一种新型、快速的吡嗪酰胺药敏试验新方法——吡嗪酰胺水解酶分析法

由于世界范围内AIDS的流行和大量流动人口的迁移,结核病在全球范围内的发病率大大回升,耐多药结核病逐年增多并广泛传播,给公众健康带来极大危胁,世界防痨工作也面临极大挑战.目前对抗耐多药结核病的手段有:开发研制新的抗痨药物,研制及时准确的药物敏感试验方法,推行DOTS疗法等等.全球绝大多数国家都在开展结核分枝杆菌敏感试验,为临床用药提供依据.但其中重要的一线抗痨药吡嗪酰胺的敏感试验一直是实验室的一个难题和焦点[1].因为吡嗪酰胺只在pH为5.5的环境中才呈现最大抗菌活性,而结核分枝杆菌在酸性条件下生长很差,导致药敏结果不稳定,甚至无结果[2].

假单胞菌菌株ON-4a中的一个新型N—氨基甲酰—L—氨基酸酰胺水解酶：在大肠杆菌中表达的N—氨基甲酰—L—半胱氨酸酰胺水解酶的纯化和特性研究 Ohmachi T等[Appl microbiol biotechnol，2004，65（6）：686．693]

从表达编码假单胞菌菌株ON-4a的N-氨基甲酰-L-半胱氨酸(NCC)酰胺水解酶基因的大肠杆菌的粗提物中纯化了NCC酰胺水解酶并进行了特性研究。用三步柱色谱将该酶纯化58倍达到同质，收率为16．1％。在交联葡聚糖S-300上的凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明该酶是同一45kD的亚单位的四聚物蛋白。酶活性的最适pH和温度分别为9．0和50℃。

重组大肠杆菌共表达D-海因酶和N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶

通过PCR分别扩增得到N-carbamoylase基因和上游带有RBS区的D-hydantoinase基因,并将其依次克隆入pBAD/HisA质粒中,得到呈多顺反子结构的双酶表达质粒pBAD-CRH,转化E.coliTop10F′得到重组菌TaraCRH.实验证明,E.coliTaraCRH对外源蛋白的表达控制严紧,而加入阿拉伯糖诱导后可以成功表达两酶基因.诱导条件优化结果表明,诱导温度采用29℃,培养基中阿拉伯糖浓度0.05g/L可达到最高酶活.进一步尝试采用玉米浆培养基代替LB培养基,在经过优化的玉米浆培养基中培养TaraCRH菌株,经阿拉伯糖诱导,海因酶和水解酶酶活分别达到3.52和4.21U/mL.

四季豆幼苗脲基乙醇酸酰胺水解酶性质的研究

为进一步研究固氮植物酰脲代谢过程，系统研究了四季豆幼苗脲基乙醇酸酰胺水解酶的一些性质和底物类似物及其它化合物对该酶的影响。研究发现，四季豆干种子中有该酶，在种子萌发的第６ｄ酶活力迅速达到最大值（８．７２ｎｍｏｌ／ｍｉｎｍｇ）。幼苗根中酶的比活力最高，而茎和叶中的酶占总酶活力最多。该酶贮于－３０℃，至少稳定２８ｄ，而贮于４℃条件下，２１ｄ失活９．８％。经纯化的酶液在５５℃温度条件下处理５ｍｉｎ和１０ｍｉｎ，分别失活２５．０％和２８．３％，但１０％的甘油有部分保护作用。Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋（全为２．０ｍｍｏｌ／Ｌ）几乎完全抑制酶反应。Ｌｉ２＋（２．０ｍｍｏｌ／Ｌ或０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）没有影响，Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｏ＋７、Ａｇ＋（全为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ａｇ＋（２ｍｍｏｌ／Ｌ）分别抑制２９．５％、２１．７％、２４．０％、３６．３％和５１．９％。测试其它３６种化合物（２．０ｍｍｏｌ／Ｌ）对酶反应的影响，结果：谷氨酰胺、谷氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和甘氨酸分别抑制酶活性的１８．６％、１９．８％、２８．６％、５．１％、１１．４％和９．０％；柠檬酸钠、硫代硫酸钠、草氨酸盐分别提高酶活力８７．４％、７４．７?

酰胺水解酶基因工程菌的构建及其对棘白菌素B的转化

棘白菌素B_0(ECB)去侧链母核为重要抗真菌药物阿尼芬净的半合成前体。本实验室从保存的犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)SIPI-A.2001基因组中克隆到ECB酰胺水解酶及其上下游基因,并将其构建入表达质粒pTGV2,通过接合转移的方法将此表达质粒导入到变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24中,构建可以水解ECB底物生成其母核的基因工程菌,静息细胞转化法生成ECB母核。HPLC检测表明,构建的基因工程菌可以有效水解ECB侧链,转化率达53.2%。

四季豆幼苗中尿囊酸酰胺水解酶的一些特性(英文)

酰脲代谢在许多固氮豆科植物氮素代谢中起重要作用;尿囊酸的酰胺水解酶(EC3.5.3.9)分解尿囊酸成为脲基乙醇酸和 CO2、NH3,脲基乙醇酸的酰胺水解酶进一步分解脲基乙醇酸产生乙醛酸和 CO2、NH3。该文首次报告测定四季豆尿囊酸降解酶(分解尿囊酸的酶)的方法, 酶反应基质需要盐酸苯肼存在。在四季豆干种子、幼苗根、茎和叶, 均可测出尿囊酸降解酶活力。从四季豆幼苗分离出两个尿囊酸降解酶。一个分子量大于200 kD,另一个分子量为 13.5 kD;小分子量的尿囊酸降解酶(没有脲基乙醇酸酰胺水解酶或脲酶活力)用于性质研究。酶反应产物分析表明,该酶是尿囊酸的酰胺水解酶。该酶反应的最适pH为8.5。Mn2+ 是该酶的金属辅助因子。Km 为 76 μmol/L,Vmax 为 16.7 nKat/mg (=1 002 nmol min-1 mg-1)。乙醛酸和乙醇酸抑制该酶活力。赖氨酸残基和色氨酸残基是酶活力的必需基团;巯基和酪氨酸残基不是酶活力的必需基团。