不同顶体精氨酸酰胺酶活性精子的其他精子参数分析

目的通过研究精子顶体精氨酸酰胺酶活性与精子常规和形态之间的关系,评估其在男性不育诊疗中的价值。方法用化学比色法检测精子顶体精氨酸酰胺酶活性,采用计算机辅助分析检测精液常规参数、精子形态精子。结果顶体酶异常组与顶体酶正常组的精子浓度、活动率、前向运动率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。顶体酶正常组与顶体酶异常组精子头部畸形百分率、颈和中段畸形百分率、主段和尾部畸形百分率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论精子顶体精氨酸酰胺酶对判断精子质量具有非常高的价值,可作为评价精子功能,辅助诊断男性不育的有效指标。

影响五步蛇毒蛋白C激活剂酰胺酶活性的实验因素

目的:探讨可能影响皖南地区五步蛇毒蛋白C激活物(PCA)酰胺酶活性的实验因素。方法:分别采用发色底物法和APTT法检测皖南地区五步蛇毒PCA在不同实验条件下的酰胺酶活性。结果:当实验温度为37℃时该PCA活性最稳定,而温度升高或降低均会抑制其酰胺酶活性(P<0.05);该PCA在pH值为7.0时活性最稳定,偏酸或偏碱则均会明显抑制其活性(P<0.05);但一定浓度范围内的Na+、K+、枸橼酸钠等对其活性无明显影响(P>0.05)。结论:五步蛇毒PCA是一种效价较高、影响因素较少的蛋白C活化试剂。

家蚕血液、消化液中酸性核糖核酸酶和天冬酰胺酶活性的初步研究

测定了家蚕夏芳、长灰A和大造各品种血液、消化液中酸性核糖核酸酶及家蚕秋白、夏芳、长灰A和大造各品种天冬酰胺酶活性变化。结果表明 :各品种血液、消化液中酸性核糖核酸酶、天冬酰胺酶活性变化随发育呈现较强的规律性 ,血液中 ,4龄第 3d、5龄第 3d这两种酶均出现峰值 ,4龄眠前活性较低 ,消化液中 ,5龄第 3d这两种酶活性均较高 ,不同品种这两种酶活性峰值出现时间稍有差异 ;各品种血液中酸性核糖核酸酶、天冬酰胺酶活性均明显高于相应品种消化液中这两种酶活性 ;各品种之间血液、消化液中这两种酶活性有明显差异。

培门冬酶治疗成人Ph/BCR-ABL1阴性急性淋巴细胞白血病药物活性与疗效

目的:观察Ph/BCR-ABL1(Philadelphia chromosome/breakpoint cluster region-Abelson 1)阴性急性淋巴细胞白血病的诱导治疗过程中培门冬酶(pegaspargase,PEG-asp)的药物活性与疗效的关系。方法:2016年10月至2018年9月收治66例成人Ph/BCR-ABL1阴性急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者,均采用联合化学治疗(化疗)方案诱导治疗,VDCP方案(长春新碱、依达比星、环磷酰胺、甲泼尼龙)16例(对照组),VDPCP方案(VDCP加PEG-asp)50例(治疗组)。检测治疗组第0、7和14天血清左旋门冬酰胺酶(L-asparaginase,L-asp)活性,比较不同时间节点的血清L-asp活性变化与疗效的关系。结果:治疗组和对照组诱导治疗的完全缓解(complete remission,CR)率分别为96%(48/50)和75%(12/16),2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2组30个月总生存(overall survival,OS)率分别是74.6%和47.9%(P=0.050);30个月无进展生存(progress-free survival,PFS)率分别是74.2%和46.2%,差异有统计学意义(P<0.05)。在治疗组中,微小残留病变(minimal residual disease,MRD)阴性患者第14天的L-asp活性显著高于MRD阳性患者(P<0.05)。常见不良反应为Ⅳ度骨髓抑制、1~2级的肝功能异常、纤维蛋白原降低和血糖升高,在2组患者中差异无统计学意义(均P>0.05)。未见血栓形成和胰腺炎等严重不良反应,且无一例死亡。结论:在成人Ph/BCR-ABL1阴性ALL的诱导治疗过程中,治疗组CR率和PFS率均高于对照组。第14天血清L-asp活性高的患者诱导结束后MRD更易转阴。在成人Ph/BCR-ABL1阴性ALL诱导治疗中,尽早使用PEGasp可以提高疗效,且不良反应小,可作为其初发治疗的一线药物。

过敏和沉默失活状态下门冬酰胺酶的药代动力学研究

目的通过门冬酰胺酶(Asp)活性检测,了解正常、过敏以及沉默失活状态下培门冬酰胺酶(Peg-asp)和欧文氏菌门冬酰胺酶(Erw-asp)的药代动力学并指导临床用药。方法单次肌注Peg-asp后,分别于注射后8d、15d、22d检测血清门冬酰胺酶(Asp)活性;单次注射Erw-asp后,分别于注射后24h、48h、72h、96h检测Asp活性。结果 206例急性淋巴细胞白血病患儿进行了957次Asp活性检测,其中66例患儿单次肌注Peg-asp 2000u/m^2,均能维持有效活性达3周;Pegasp用药后存在沉默失活现象,发生率5%左右;26例既往有普通大肠杆菌门冬酰胺酶(Ecoli-asp)过敏史的患儿换用Peg-asp后,Asp活性半衰期大大缩短。74例患儿使用Peg-asp、Ecoli-asp发生过敏或者沉默失活后,换用Erw-asp均能获得有效酶活性;国产Erw-asp肌注后的活性半衰期明显长于国外文献报道(23. 1±2. 5h vs. 15. 6±3. 1h)。结论 Peg-asp推荐给药剂量2000u/m^2,推荐给药间隔3周一次;Peg-asp治疗中,可能会发生沉默失活,需要警惕;Peg-asp与Ecoli-asp存在交叉免疫原性,对一种过敏后不宜简单更换为另一种;Erw-asp作为二线用药能在Peg-asp、Ecoli-asp过敏或沉默失活后获得有效活性,依据药代动力学,国产制剂推荐剂量为20000u/m^2,每周2次。

两种门冬酰胺酶对Jurkat和RS4;11细胞的细胞毒性差异研究

目的比较谷氨酰胺酶活性不同的两种门冬酰胺酶(L-ASP)对急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat(L-ASP耐药)和RS4;11(L-ASP敏感)的细胞毒性,探讨门冬酰胺酶的谷氨酰胺酶活性对抗肿瘤效应的影响。方法(1)通过基因工程方法获得野生型门冬酰胺酶(WT)和低谷氨酰胺酶活性的突变型门冬酰胺酶(MT)。(2)用CCK-8试剂盒检测WT和MT对Jukat细胞和RS4;11细胞的增殖毒性。(3)绘制WT和MT作用下Jurkat细胞的生长曲线。(4)用流式细胞术检测WT和MT诱导Jurkat细胞凋亡情况。结果(1)与WT相比,MT的谷氨酰胺酶活性和门冬酰胺酶活性比值明显降低(0.9%±0.1%vs.12.2%±2.8%,P<0.05)。(2)1.0 IU/mL的WT和MT处理Jurkat细胞48h抑制率分别为(96.07±1.19)%和(45.60±4.38)%,差异具有显著性(P<0.05);WT和MT对RS4;11细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.127±0.012)IU/L和(0.116±0.014)IU/L,差异无显著性(P=0.331)。(3)生长曲线显示0.1 IU/mL的WT显著抑制Jurkat细胞增殖,0.1 IU/mL的MT不能抑制Jurkat细胞增殖。(4)1.0 IU/mL的WT和MT处理Jurkat细胞24h细胞凋亡率分别为(37.27±6.89)%和(13.02±3.87)%,差异具有显著性(P<0.05)。结论L-ASP的谷氨酰胺酶活性可以增强L-ASP对Jurkat细胞的抗肿瘤效应,但不能增强L-ASP对RS4;11细胞的抗肿瘤效应。

皱纹盘鲍肽聚糖识别蛋白的表达及免疫功能特性

为研究皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肽聚糖识别蛋白HdhPGRP-SC2-like的免疫功能特性,利用RACE技术克隆了HdhPGRP-SC2-like基因的全长cDNA序列,采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析了HdhPGRP-SC2-like基因的组织分布特征,通过原核表达获得了重组蛋白rHdhPGRP-SC2-like,并对其酰胺酶活性及免疫特性进行了验证。结果表明:HdhPGRP-SC2-like基因的cDNA全长为938 bp,开放阅读框为780 bp,编码260个氨基酸,包含保守的PGRP结构域和Ami_2结构域;HdhPGRP-SC2-like属于短型PGRP,与软体动物近缘物种PGRP具有高度相似性;qPCR分析显示,HdhPGRP-SC2-like mRNA在皱纹盘鲍各组织中均有表达,其中,鳃中表达量最高,外套膜、消化腺中表达量次之,腹足和血细胞中表达量较低;进一步构建原核表达载体pET-28a(+)-HdhPGRP-SC2-like,经诱导表达、分离纯化获得重组蛋白rHdhPGRP-SC2-like,该蛋白具有肽聚糖结合活性,且在Zn2+存在的情况下显示出酰胺酶活性。研究表明,HdhPGRP-SC2-like能够结合细菌肽聚糖成分,在机体抵御入侵细菌等免疫防御中发挥重要作用。

大鲵短型肽聚糖识别蛋白PGRP-S的克隆及其功能研究

实验构建了大鲵短型肽聚糖识别蛋白PGRP-S的真核表达质粒,并对其功能进行了初步的研究。序列分析显示,所克隆的大鲵PGRP-S的N端不含有信号肽;其编码的氨基酸序列具有2个相距较近的半胱氨酸残基以及2个Zn2+结合位点。Western-blotting检测结果显示大鲵PGRP-S既可分泌到胞外,也可滞留在胞内。体外抗菌实验的结果表明,过表达大鲵PGRP-S能显著抑制迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)在HEK293T细胞内和胞外培养基中的增殖。此外,过表达大鲵PGRP-S能诱导NF-κB启动子的活性;能结合Lys-type和Dap-type的肽聚糖但不能降解它们。研究结果表明大鲵PGRP-S在功能上类似于哺乳动物而有别于硬骨鱼类短型的肽聚糖识别蛋白。

斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白S2调节共生菌稳态的功能分析

目的研究斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白S2(PGRP‑S2)的功能及其对按蚊体内共生菌稳态的影响。方法将羽化后2~4日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10%蔗糖溶液)、感染血组(叮咬原虫血症为4%~8%的伯氏疟原虫ANKA感染小鼠)和健康血组(叮咬健康小鼠),每组60只,饱血24 h后分离中肠和其余组织,用Trizol法提取RNA,实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)检测pgrp⁃s2基因的相对转录水平。将羽化后0~1日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10%蔗糖溶液)与抗生素处理组(喂食含有青霉素、链霉素和庆大霉素的10%蔗糖溶液),每组30只,喂养5 d后分离中肠和其余组织,RT‑qPCR检测pgrp⁃s2基因的相对转录水平。将雌性斯氏按蚊分为pgrp⁃s2敲低组和绿色荧光蛋白基因(gfp)对照组,每组60只,分别注射pgrp⁃s2的双链RNA(dsRNA)和gfp基因dsRNA(69 nl/只),2 d后每组取蚊虫提取RNA,RT‑qPCR检测pgrp⁃s2的相对转录水平,提取DNA并使用16S rRNA特异性引物PCR检测蚊虫体内共生菌总量。分别取30只pgrp⁃s2敲低组和gfp对照组按蚊,用107个/ml摩氏摩根氏菌液浸湿棉球喂养5 d后,提取RNA,RT‑qPCR检测获得共生菌16S rRNA相对总量和摩氏摩根氏菌的相对数量;提取pgrp⁃s2敲低组和gfp对照组按蚊中肠组织RNA,转录组测序后进行聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析。使用SMART网站预测分析PGRP‑S2氨基酸序列后利用CLC Main Workbench软件进行比对。克隆按蚊pgrp⁃s2基因,利用昆虫杆状病毒表达系统(pFastbacⅠ)在SF9细胞中表达PGRP‑S2重组蛋白,Western blotting检测蛋白表达情况。取10、20、40μg/ml纯化后的PGRP‑S2重组蛋白溶液(以蛋白缓冲液为对照)分别与40μg赖氨酸(Lys)型肽聚糖和二氨基庚氨酸(DAP)型肽聚糖孵育,每间隔12 h测定相对吸光度(A540值)以判定肽聚糖的降解情况,验证PGRP‑S2的酰胺酶活性。结果RT‑qPCR结果显示,吸血后24 h,感染血组、健康血组和对照组按蚊中肠pgrp⁃s2的相对转录水平分别为1590.0±665.2、126.8±100.4和15.84±6.92,感染血组高于对照组(t=2.38,P<0.05);对照组按蚊中肠的pgrp⁃s2的相对转录水平高于其余组织(1.71±0.51)(t=2.04,P<0.05)。抗生素处理组按蚊中肠pgrp⁃s2的相对转录水平为0.33±0.18,低于对照组的117.9±54.5(t=2.16,P<0.05)。pgrp⁃s2敲低组按蚊体内共生菌16S rRNA相对总量为3653±2023,低于gfp对照组的14982±3892(t=2.58,P<0.05);摩氏摩根氏菌饲喂后,pgrp⁃s2敲低组按蚊体内摩氏摩根氏菌的相对数量为571517±61258,低于gfp对照组的919754±123397(t=2.53,P<0.05)。转录组分析结果显示,pgrp⁃s2敲低可以上调按蚊免疫相关的Toll/Imd通路、mTOR通路、FoxO通路基因,下调脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢相关基因。10、20、40μg/ml PGRP‑S2重组蛋白与DAP型肽聚糖孵育48 h后,相对A540值分别为0.49±0.07、0.40±0.10和0.44±0.07,均低于对照的0.90±0.09(t=3.53、3.65、3.97,均P<0.05);但与Lys型肽聚糖孵育48 h后,相对A540值分别为0.52±0.03、0.62±0.03和0.65±0.04,与对照(0.64±0.05)的差异均无统计学意义(t=1.95、0.31、0.11,均P>0.05)。结论斯氏按蚊体内pgrp⁃s2主要在中肠表达,且表达水平受共生菌调控。PGRP‑S2重组蛋白可以降解DAP型肽聚糖,具有酰胺酶活性,可通过负调节免疫反应和调节代谢反应调控按蚊体内共生菌水平。