SWEET(sugars will eventually be exported transporter)基因在植物开花过程中具有重要的作用,但AcSWEET11在菠萝成花中的作用机制尚不清楚。通过鉴定成花过程中与AcSWEET11的互作蛋白,为菠萝成花机制的解析奠定基础。本研究利用共转...SWEET(sugars will eventually be exported transporter)基因在植物开花过程中具有重要的作用,但AcSWEET11在菠萝成花中的作用机制尚不清楚。通过鉴定成花过程中与AcSWEET11的互作蛋白,为菠萝成花机制的解析奠定基础。本研究利用共转化的方法在菠萝成花过程的cDNA膜文库中筛选AcSWEET11的互作蛋白,分析候选蛋白的表达量。结果表明,pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N对NMY51酵母细胞无毒性,但有自激活活性。进一步研究结果显示,在TDO/3?AT培养基和QDO培养基上自激活受到抑制。利用该系统筛选到了81个阳性克隆,经测序鉴定出48个与AcSWEET11互作的候选蛋白,包括E3 ubiquitin-protein ligase RING1-like、Trehalose-phosphate synthase 7、Cytochrome P450、TranscriptionfactorLUX等。GO和KEGG分析结果显示,48个蛋白主要分布在细胞进程、代谢过程、刺激反应和催化活性等生物过程,参与脂类代谢、氨基酸代谢和碳水化合物代谢、信号转导和运输与分解代谢等新陈代谢途径。Trehalose-phosphate synthase 7(XP_020105459.1)、Protein TIFY 3-like(XP_020082835.1)、40S ribosomal protein S27(XP_020092770.1)、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 1-like(XP_020112516.1)等4个基因与AcSWEET11表达趋势一致,在菠萝成花过程中下调表达;Dihydrolipoyl dehydrogenase 2(XP_020113798.1)、Putative lipid-transfer protein DIR1(XP_020086640.1)、clathrin assembly protein At4g32285(XP_020108161.1)等3个基因在菠萝成花过程中上调表达。这些结果表明,AcSWEET11可能通过与Trehalose-phosphatesynthase7等蛋白发生互作,参与菠萝成花过程。本研究进一步丰富了AcSWEET11的蛋白互作网络,为AcSWEET11在菠萝成花中的调控机制的解析奠定基础。展开更多
【目的】种子大小直接影响花生的产量。前期通过QTL定位获得调控花生种仁大小的关键转录因子AhSAP1,构建花生胚酵母双杂交cDNA文库,并以AhSAP1为诱饵进行酵母双杂交筛选互作蛋白,分析候选互作蛋白基因的时空表达特征,为深入研究AhSAP1...【目的】种子大小直接影响花生的产量。前期通过QTL定位获得调控花生种仁大小的关键转录因子AhSAP1,构建花生胚酵母双杂交cDNA文库,并以AhSAP1为诱饵进行酵母双杂交筛选互作蛋白,分析候选互作蛋白基因的时空表达特征,为深入研究AhSAP1调控花生种仁发育的分子机制奠定基础。【方法】用SMART(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript)法构建花生胚大肠杆菌cDNA文库并进行鉴定;构建诱饵载体pGBKT7-AhSAP1,并鉴定其对酵母细胞的毒性以及自激活性。将花生胚cDNA文库质粒与诱饵质粒pGBKT7-AhSAP1共转Y2H Gold酵母菌株,筛选长势较好且呈蓝色的阳性菌落,测序比对,获得候选互作蛋白基因序列,预测生物学功能。利用RNA-seq明确候选互作蛋白基因在花生不同组织器官、受外源植物激素诱导及低钙胁迫诱导下的表达特征。根据功能注释结果,选取可能参与植物种子发育的候选因子,扩增其CDS全长序列,构建到靶标载体pGADT7后,分别与pGBKT7-AhSAP1共转化酵母细胞进行点对点酵母双杂交互作验证。【结果】花生胚大肠杆菌次级cDNA文库滴度为1.05×10^(8) cfu/mL,重组率为98%,平均插入片段大小约1000 bp,文库质量较高;成功构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-AhSAP1,在酵母细胞中没有自激活性且对酵母菌没有毒性;筛选得到68个酵母阳性克隆,经序列相似性比对,去除重复,共获得60个候选互作蛋白,主要参与能量产生与代谢、翻译、核糖体结构和生物发育、转录、信号转导机制、翻译后修饰、无机离子运输和代谢、染色质结构等。选取12个候选互作蛋白与AhSAP1进行一对一酵母双杂交验证,有8个候选互作蛋白与AhSAP1发生互作。【结论】成功构建了花生胚发育不同时期的混合cDNA文库,筛选出60个与AhSAP1互作的候选互作蛋白,主要涉及能量产生与代谢、翻译、核糖体结构和生物发生、转录、信号转导机制、翻译后修饰、无机离子运输和代谢、染色质结构等,这些候选互作蛋白基因在花生根、茎、叶、花序、果针、果皮、种皮及胚中均有表达,明确了8个候选互作蛋白与AhSAP1的互作关系。展开更多
文摘SWEET(sugars will eventually be exported transporter)基因在植物开花过程中具有重要的作用,但AcSWEET11在菠萝成花中的作用机制尚不清楚。通过鉴定成花过程中与AcSWEET11的互作蛋白,为菠萝成花机制的解析奠定基础。本研究利用共转化的方法在菠萝成花过程的cDNA膜文库中筛选AcSWEET11的互作蛋白,分析候选蛋白的表达量。结果表明,pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N对NMY51酵母细胞无毒性,但有自激活活性。进一步研究结果显示,在TDO/3?AT培养基和QDO培养基上自激活受到抑制。利用该系统筛选到了81个阳性克隆,经测序鉴定出48个与AcSWEET11互作的候选蛋白,包括E3 ubiquitin-protein ligase RING1-like、Trehalose-phosphate synthase 7、Cytochrome P450、TranscriptionfactorLUX等。GO和KEGG分析结果显示,48个蛋白主要分布在细胞进程、代谢过程、刺激反应和催化活性等生物过程,参与脂类代谢、氨基酸代谢和碳水化合物代谢、信号转导和运输与分解代谢等新陈代谢途径。Trehalose-phosphate synthase 7(XP_020105459.1)、Protein TIFY 3-like(XP_020082835.1)、40S ribosomal protein S27(XP_020092770.1)、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 1-like(XP_020112516.1)等4个基因与AcSWEET11表达趋势一致,在菠萝成花过程中下调表达;Dihydrolipoyl dehydrogenase 2(XP_020113798.1)、Putative lipid-transfer protein DIR1(XP_020086640.1)、clathrin assembly protein At4g32285(XP_020108161.1)等3个基因在菠萝成花过程中上调表达。这些结果表明,AcSWEET11可能通过与Trehalose-phosphatesynthase7等蛋白发生互作,参与菠萝成花过程。本研究进一步丰富了AcSWEET11的蛋白互作网络,为AcSWEET11在菠萝成花中的调控机制的解析奠定基础。
文摘【目的】种子大小直接影响花生的产量。前期通过QTL定位获得调控花生种仁大小的关键转录因子AhSAP1,构建花生胚酵母双杂交cDNA文库,并以AhSAP1为诱饵进行酵母双杂交筛选互作蛋白,分析候选互作蛋白基因的时空表达特征,为深入研究AhSAP1调控花生种仁发育的分子机制奠定基础。【方法】用SMART(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript)法构建花生胚大肠杆菌cDNA文库并进行鉴定;构建诱饵载体pGBKT7-AhSAP1,并鉴定其对酵母细胞的毒性以及自激活性。将花生胚cDNA文库质粒与诱饵质粒pGBKT7-AhSAP1共转Y2H Gold酵母菌株,筛选长势较好且呈蓝色的阳性菌落,测序比对,获得候选互作蛋白基因序列,预测生物学功能。利用RNA-seq明确候选互作蛋白基因在花生不同组织器官、受外源植物激素诱导及低钙胁迫诱导下的表达特征。根据功能注释结果,选取可能参与植物种子发育的候选因子,扩增其CDS全长序列,构建到靶标载体pGADT7后,分别与pGBKT7-AhSAP1共转化酵母细胞进行点对点酵母双杂交互作验证。【结果】花生胚大肠杆菌次级cDNA文库滴度为1.05×10^(8) cfu/mL,重组率为98%,平均插入片段大小约1000 bp,文库质量较高;成功构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-AhSAP1,在酵母细胞中没有自激活性且对酵母菌没有毒性;筛选得到68个酵母阳性克隆,经序列相似性比对,去除重复,共获得60个候选互作蛋白,主要参与能量产生与代谢、翻译、核糖体结构和生物发育、转录、信号转导机制、翻译后修饰、无机离子运输和代谢、染色质结构等。选取12个候选互作蛋白与AhSAP1进行一对一酵母双杂交验证,有8个候选互作蛋白与AhSAP1发生互作。【结论】成功构建了花生胚发育不同时期的混合cDNA文库,筛选出60个与AhSAP1互作的候选互作蛋白,主要涉及能量产生与代谢、翻译、核糖体结构和生物发生、转录、信号转导机制、翻译后修饰、无机离子运输和代谢、染色质结构等,这些候选互作蛋白基因在花生根、茎、叶、花序、果针、果皮、种皮及胚中均有表达,明确了8个候选互作蛋白与AhSAP1的互作关系。
