酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP6 蛋白结合蛋白的基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV NS3TP6蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出HCV NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个,其中3个人类白细胞CD14抗原,1个人类免疫球蛋白入轻链,3个人类推定蛋白基因(AC124014,AC097504,AC023785). 结论:成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.

酵母双杂交系统筛选与水稻条纹病毒Pc2互作的寄主蛋白基因片段

水稻条纹病毒编码的Pc2蛋白在病毒侵染及宿主症状发生中起作用。研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染与致病的分子机制。分别将编码Pc2N端（Pc2-N）与Pc2C端（Pc2-C）的基因片段克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上．并构建水稻叶片cDNA文库．然后分别用Pc2-N和Pc2-C为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明．诱饵载体中插入的Pc2-N和Pc2-C编码框和氨基酸序列均正确。Pc2-N对酵母菌株AHl09无毒性和自主激活能力，但Pc2-C对酵母具有细胞毒性。文库滴度为4x107CFU／mL．且大多数插入片段在500～2000bp之间。利用Pc2-N为诱饵筛选水稻cDNA文库．获得有8个候选阳性克隆。经序列测定和BLAST分析结果表明．这些克隆共编码5种蛋白．主要为胁迫相关蛋白与光系统相关蛋白。

用酵母双杂交筛选与南瓜蚜传黄化病毒MP互作的寄主因子

植物病毒编码的移动蛋白(movement protein,MP)介导病毒在寄主体内的移动,研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染过程中的分子机制。将南瓜蚜传黄化病毒Cucurbit aphid-borne yellows virus(CABYV)MP基因定向克隆到含有DNA结合功能域(DNA-binding domain,BD)载体上,并构建与激活功能域(activation domain,AD)融合表达的西瓜茎叶cDNA文库,然后用MP为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明,诱饵质粒插入的MP基因可读框和氨基酸序列均正确,对酵母菌株AH109和Y187没有自主激活能力;文库滴度为2.94×106CFU/mL,且大多数插入片段在700bp以上,质量符合筛选要求;经过筛选和共转化回转验证,有48个候选阳性克隆与MP在酵母中互作。测序得到这些克隆的cDNA序列,BLAST分析结果表明,这些克隆共编码12种蛋白。

利用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P1互作的寄主蛋白

小麦黄花叶病是我国冬小麦上重要的病毒病害之一,自20世纪90年代以来,每年发生面积都在66万hm^2以上,一般减产10%-30%,严重的达70%以上。该病害在我国河南、江苏、山东、安徽、陕西、湖北、四川等省均有分布,

酵母双杂交文库筛选及hTRIP15与Y盒结合蛋白-1相互作用的探讨

为探讨甲状腺素受体相互作用蛋白(hTRIP15)是否与其他核蛋白发生相互作用,以hTRIP15作为诱饵,用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库,在高严格度选择培养基(SD-Trp-Leu-Ade-His)上长出的克隆773个,再经β-gal表达和PCR等技术进一步缩小范围,经Blastn搜寻最终显示2个重复克隆编码一种共调节辅因子——Y盒结合蛋白-1(YB-1).将插入序列与全长YB-1比较发现进入ORF内230bp,插入序列编码82aa,该蛋白称为YB-1-p,经蛋白体外翻译及GST-pulldown试验证实YB-1-p与hTRIP15发生相互作用.提示hTRIP15可通过与YB-1相互作用,参与调控MHCII及TSH受体等甲状腺细胞重要基因表达.

酵母双杂交法筛选组织蛋白酶B相互作用蛋白质

组织蛋白酶B是肿瘤侵袭和转移密切相关的一种蛋白酶,研究其作用网络对于开发基于组织蛋白酶B的抗肿瘤药物非常重要。采用酵母双杂交技术构建相关文库,以人组织蛋白酶B作为诱饵蛋白质,寻找其在肿瘤细胞中的直接相互作用蛋白质。在84个初始阳性克隆中,共有15个能通过3个报告基因的检测。BLAST分析发现,在GenBank数据库中可以匹配7个基因,编码7种已知的蛋白质:BCL2-associated athanogene 6 (BAG6), filaminA,alpha(FLNA),ras homolog family member G (RHOG),metallothionein 2A (MT2A), ZXD family zinc finger C(ZXDC),DEP domain containing 7(DEPDC7),A kinase(PRKA) interacting protein 1(AKIP1)。

酵母双杂交随机肽库的设计及构建

构建一个含16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库,设计合成编码16肽的随机DNA片段,PCR扩增随机DNA片段,经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH-RP并检验其库容。结果表明,扩增获得编码16肽的随机DNA片段,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,与GAL4AD形成融合蛋白,其库容为1.28×107。从而成功地构建了酵母双杂交随机肽库。

一个ALS家系突变SOD1编码蛋白的相互作用蛋白筛选

目的:筛选与突变SOD1编码蛋白相互作用的蛋白。方法:应用Clontech酵母双杂交系统3,对人胎脑cD-NA文库进行筛选。把构建成功的质粒pGBKT7-mSOD1cDNA转染酵母菌AH109,再与含有已克隆到pACT2载体上的人胎脑cDNA文库的酵母菌Y187杂交融合。突变的SOD1cDNA与相应的人胎脑cDNA片段编码的蛋白发生相互作用后,可激活基因的表达,筛选出阳性克隆,对阳性克隆的质粒进行测序分析。在GenBank中作匹配及生物信息学分析。结果:共筛选出15个阳性克隆,其中包括9个为已知蛋白,6个为未知蛋白。其中包括PTPN2(protein tyrosinephos phatase,non-receptor type2)。结论:突变SOD1可能通过这些相互作用的蛋白进行相互调控,改变了正常SOD1酶的信号传导通路,从而使机体患病。

ABIN蛋白家族结合泛素链与A20参与调控NF-κB的影响与意义

1 ABIN概述ABIN蛋白家族包含ABIN1、ABIN2、ABIN3三种蛋白,这三种蛋白都显示出有限的序列同源性：含有同源区域AHD1和泛素交联区域UBAN（图1）。AHD1可介导ABIN蛋白与A20相结合,UBAN可介导ABIN与泛素相交联,通过ABIN结合泛素、A20编辑泛素的方式来抑制NF-κB的活化,这体现出了ABIN蛋白家族的同一性。

新加坡科学家发现植物造花的“开关”

开花是植物,包括世界所依赖的作物生长全过程的最重要的行为,一如由此结出果实以及下一代的种植生长。一直以来极少有人知道在不同的环境条件下是什么精确地促发了植物造花而不是造叶。目前,新加坡国立大学的一个研究小组发现了这一过程是如何发生的。这个由该大学生物科学系教授Yu Hao领导的研究小组鉴定出一种在正常光照下开花所必需的蛋白质。该小组的研究结果发表在2012年4月的在线《PLo S Biology》杂志上。

植保所揭示水稻-稻瘟菌互作过程新机制

近日,从中国农业科学院植物保护研究所获悉,由王国梁研究员领衔的研究团队通过分析鉴定稻瘟菌效应蛋白在水稻中靶标蛋白,揭示了水稻-稻瘟菌互作过程中的新机制。相关研究结果9月15日以长文形式在线发表在《细胞（Cell）》杂志子刊《当代生物学（Current Biology）》杂志上。