应用酵母双杂交系统筛选FGFR3相互作用的蛋白质

目的通过酵母双杂交系统从小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库中筛选与成纤维细胞生长因子受体3(FG-FR3)相互作用的蛋白质,为研究FGFR3信号通路提供新的线索。方法构建FGFR3胞内区的真核表达载体R3-PI,转化酵母菌AH109。毒性实验及自激活实验证实FGFR3胞内区蛋白对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象。将小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库转入AH109/R3-PI酵母菌中,能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质。结果通过初步筛选得到3种能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用。结论通过筛选发现CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用,提示FGFR3可能通过CLK4参与能量代谢调节,而CLK4可能通过对FGFR3的磷酸化或去磷酸化调节FGFR3的活性。

酵母双杂交技术筛选克隆丙型肝炎病毒NS3结合蛋白基因

为克隆与丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因 ,采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选。构建HCVNS3蛋白诱饵酵母质粒 ,转化酵母AH10 9后与含文库质粒的酵母Y187进行配合 ,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。选择既能在 4重营养缺陷培养基(SD/ Trp Leu Ade His)上生长 ,又能在涂有X α 半乳糖(X α gal)的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落 ,提取此酵母克隆的质粒 ,转化大肠杆菌后进行测序 ,并进行生物信息学分析。分析的结果显示 ,筛选出 19个阳性克隆 ,包括已知功能基因 17个 ,还有 1个克隆的测序结果与GenBank中的 1个未知功能序列有 4 4 %的同源性 ,初步证明了此基因与HCVNS3有结合活性。说明成功克隆了HCVNS3蛋白结合蛋白基因 ,为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索。

应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的 :应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem10 4相互作用的蛋白 ,为该基因的功能研究提供线索。方法 :构建AngRem10 4的真核表达载体AngRem10 4 pGBKT7/c myc,转化酵母菌AH10 9,Westernblot证实蛋白表达 ,进行毒性和自激活检验 ,与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,筛选与AngRem10 4相互作用的蛋白。结果 :AngRem10 4蛋白能在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子 1α1、糖皮质激素受体AF 1特异延伸因子、β2 微球蛋白、巴戴 -比德尔综合征 2蛋白及 4个与细胞代谢有关的蛋白。结论 :AngRem10 4可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢 ,并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem10

酵母双杂交技术筛选白细胞中HCVNS3蛋白结合蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增 NS3基因,连接入酵母表达载体 pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞 Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出 NS3基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有 X-α-半乳糖(x-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落18个,其中4个真核细胞翻译延伸因子2;2个免疫球蛋白λ轻链;1个肌动蛋白β;1个铁蛋白轻多肽;1个(丝裂原)活化蛋白激酶3;2个肌球蛋白因子1;1个白介素2受体β;1个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6;1个组织蛋白酶 S;1个2’-5’寡腺甘酸合成酶类似物;1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个 CNN2;1个新基因.结论:成功克隆出 HCV NS3的结合蛋白,为进一步研究HCV 的作用提供了新线索.

应用酵母双杂交系统筛选与新基因nelin相互作用的蛋白质

目的 通过筛选能够与新基因nelin的心肌特异表达产物相互作用的蛋白质从而揭示nelin的生物功能。方法 构建表达nelin阅读框全长的诱饵质粒并利用酵母双杂交系统筛选人心脏cDNA文库, 以寻找与nelin蛋白发生相互作用的蛋白质。并利用生物信息学方法对筛选得到的蛋白质进行功能结构域分析。结果 筛选得到3 个蛋白质分别为肌联蛋白 (Titin ) N2B亚型, 细丝蛋白 (Filamin ) C亚型即γ Filamin和α胰蛋白酶抑制物重链前体 (inter alphatrypsin inhibitor heavy chain precursor, ITIH)。对这3种蛋白的C末端结构域进行分析发现Titin和Filamin均含有免疫球蛋白样结构域 (Ig- like domain)。结论 实验结果揭示了新基因nelin很可能表达一个细胞骨架相关蛋白, 它可通过其蛋白质的C末端同Titin和Filamin的免疫球蛋白样结构域发生相互作用而参与细胞骨架网络的形成。

利用酵母双杂交系统筛选IRR的结合蛋白

由于 型糖尿病病人对胰岛素不敏感 ,胰岛素受体相关受体 (IRR)的配体将对这些病人具有潜在的治疗作用。构建了以 IRR为筛选靶位的诱饵质粒 ,并利用酵母双杂交系统进行初步筛选 ,在筛选过程中考察氨基三唑(AT)浓度对转化子的影响。经过初筛复筛得到了 1个阳性转化子 ,测定这段 c DNA的序列并通过 Gen Bank搜寻 ,发现它编码的一段开放读框 (ORF)和δ-氨基乙酰丙酸脱水酶基因 (HEM2 )具有一定的同源性 。

酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP6 蛋白结合蛋白的基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV NS3TP6蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出HCV NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个,其中3个人类白细胞CD14抗原,1个人类免疫球蛋白入轻链,3个人类推定蛋白基因(AC124014,AC097504,AC023785). 结论:成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果成功获得COPS3基因片段,其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。

应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质

用NAP1作为"诱饵"蛋白,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,鉴定阳性克隆;再利用酵母双杂交和免疫共沉淀验证相互作用.结果表明,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,阳性克隆的鉴定,发现了与NAP1的相互作用蛋白质―蛋白酶体α亚基3(PSMA3).免疫共沉淀(Co-IP)结果证实外源表达的NAP1蛋白和PSMA3蛋白在293T细胞中有特异性的相互作用.NAP1作为FDC分泌的一种多肽,与PSMA3有特异性的相互作用,这种相互作用如何实现对蛋白酶体降解靶蛋白的活性调节,其作用机理有待深入研究.

以酵母双杂交系统筛选与N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅲ相互作用的蛋白质

用N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅲ(GNTⅢ)作诱饵,以酵母双杂交系统从胎肝cDNA文库中筛选到一种能与N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅲ发生相互作用的蛋白质。与GNTⅢ作用的是早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF),是属于视黄酸受体家庭的一种转录因子。根据这个结果和已有的一些背景理论知识,本文提出了一种新的相互作用假设模型:PLZF是GNTⅢ的底物之一。这种相互作用是已知蛋白间的未知相互作用。

酵母双杂交系统及其应用

酵母双杂交系统（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）是直接于细胞内研究蛋白质间相互作用的一种灵敏度很高，且非常有效的遗传学方法，在不同研究领域中广泛应用，并不断完善及改进，发展出单杂交系统（ｏｎｅ－ｈｙｂｉｄ ｓｙｓｔｅｍ） 和三杂交系统 （ｔｈｒｅｅ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）等一系列相关的技术，克服了原系统的局限。本文对双杂交系统的原理、发展概况、应用、存在问题和前景等进行了综述。

利用酵母双杂交筛选与DAT1的LIM2相互作用的蛋白质

目的 利用酵母双杂交系统筛选人胎脑组织中能与多巴胺相关转录因子DAT1的LIM2相互作用的蛋白质, 以初步了解DAT1的功能。方法 构建酵母双杂交诱饵质粒pLexA-LIM2,筛选人胎脑cDNA文库,并用酵母交配试验初步 验证。结果 获得3个能与DAT1的第2个LIM结构域LIM2结合的相互作用蛋白,通过酵母结合试验证实了它们在酵母 中的结合。结论 DAT1的第2个LIM结构域LIM2可与唐氏综合征关键区基因2(SimilartoDownsyndromecriticalregion gene2,DSCR2)、钙 整合素结合蛋白(calciumandintegrinbindingprotein,CIB)、和HSPC170(CD34+hematopoieticstem/progenitor cells,HSPCs)结合。

酵母双杂交系统

酵母双杂交系统是研究细胞内蛋白质之间相互作用的一种分子遗传学技术,用已知的蛋白质作为诱饵来筛选其可以相互作用的伙伴蛋白。本文简要叙述了酵母双杂交系统的原理、基本方法,以及这个技术的发展和应用。

β3整合素酵母双杂交载体的构建及鉴定

根据Genebank,设计β3膜外区引物,通过RT PCR方法扩增β3片段,然后克隆入RRS酵母双杂交载体——pYesM△playA中,构成猎物.限制性内切酶酶切鉴定表明载体构建正确,β3整合素测序正确.表明成功扩增出人β3整合素基因胞外区,构建获得β3pYesM△playA酵母表达载体.用乙酸锂法,将重组子转染至酵母温度敏感株cdc252,检测其对RRS系统的激活作用.自激活试验为阴性表明β3整合素不能自激活cdc252在36℃生长,表明该载体可用于酵母双杂交检测β3整合素与汉坦病毒受体结合蛋白(VAP)间相互作用.为进一步研究β3整合素在病毒感染中的作用奠定了基础.

猪瘟病毒酵母双杂交pGBKT7-NS3诱饵载体的构建与鉴定

利用RT-PCR技术扩增获得猪瘟病毒NS3基因片段,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切,测序验证其正确插入后,将重组诱饵质粒转化酵母菌Y2HGold,检测其在酵母中毒性和自我激活作用,并利用Western blot分析诱饵载体在酵母中的转化情况。结果表明,pGBKT7-NS3诱饵载体在Y2HGold酵母细胞中可以表达,此载体在酵母细胞Y2HGold中无毒性和自我激活能力,研究结果为使用酵母双杂交技术筛选相互作用蛋白奠定了基础。

酵母双杂交系统检测金属硫蛋白(MT)间的相互作用

金属硫蛋白 3(MT 3) ,又称神经生长抑制因子 ,为金属硫蛋白家族中惟一具有生物活性的成员。为了验证其在细胞内是否形成二聚或多聚体 ,构建酵母双杂交系统用于检测。结果表明 :MT 3与MT 3之间在酵母细胞内能发生相互作用 ,进一步用酵母双杂交实验还表明MT 3与MT 1间也存在弱相互作用。由此提示 ,在机体细胞中 ,MT 3可以以同源或异源二聚体的形式存在。

大规模的酵母双杂交系统在蛋白质相互作用组图谱中的应用

蛋白质-蛋白质之间的相互作用是蛋白质发挥其功能的重要途径之一。通过研究蛋白质组中所有蛋白质之间的相互作用做出蛋白质相互作用对图谱是功能基因组时代许多科学家关注的问题,而大规模的酵母双杂交系统是蛋白质相互作用对图谱的研究中应用较为广泛的策略。近两年来该策略最具代表的实例是用它进行酵母中所有蛋白之间相互作用的检查。但是巨大的蛋白质网络比我们想象要大得多,单一的双杂交系统不能解决所有问题,需要同其它的方法有效地结合。

双杂交系统筛选与AID相互作用蛋白的初步研究

AID(APPintracellulardomain)是由淀粉样前体蛋白APP经γ分泌酶切割产生的胞内端,它可能参与细胞凋亡,基因转录等活动,并对阿尔茨海默氏症的形成有一定影响.为进一步研究AID的功能,在本实验中,我们用AID为诱饵蛋白,运用酵母双杂交系统筛选与其结合的蛋白,得到其中两个阳性克隆,一个为RPS21,另一个为FLJ20551.接着又在酵母体系用β半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用,并在哺乳动物细胞中用免疫共沉淀的方法再次验证了它们相互作用的特异性.这些结果表明RPS21和FLJ20551可能通过与AID相互作用而影响阿尔茨海默氏症的形成.

酵母双杂交随机肽库的设计及构建

构建一个含16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库,设计合成编码16肽的随机DNA片段,PCR扩增随机DNA片段,经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH-RP并检验其库容。结果表明,扩增获得编码16肽的随机DNA片段,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,与GAL4AD形成融合蛋白,其库容为1.28×107。从而成功地构建了酵母双杂交随机肽库。

双杂交系统:新兴的检测蛋白——蛋白交互作用的有力工具

蛋白——蛋白交互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）是生命活动持续的最基本的根据，细胞内的信号传导也是研究细胞的发育、分化及疾病的生理反应所要了解的最终目标。国际上出现了一种直接于细胞内检测蛋白——蛋白交互作用且灵敏度很高的遗传学新方法，酵母双杂交系统（ｙｅａｓｔｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ），可迅速鉴别新的信息传递蛋白。本文综述了双杂交系统的原理、发展概况、应用范围及需注意的一些问题，并对它将来的发展及应用作了一些展望。