利用酵母双杂交系统筛选β-内酰胺酶的结合肽

构建了含有来自于质粒pBR322的β-内酰胺酶基因的诱饵质粒,利用酵母双杂交系统从随机序列八肽库中进行筛选,通过初筛、复筛验证获得了1个阳性转化子。DNA序列测定结果表明其编码了1段八肽,体内显示具有结合β-内酰胺酶的能力。

酵母双杂交随机肽库的设计及构建

构建一个含16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库,设计合成编码16肽的随机DNA片段,PCR扩增随机DNA片段,经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH-RP并检验其库容。结果表明,扩增获得编码16肽的随机DNA片段,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,与GAL4AD形成融合蛋白,其库容为1.28×107。从而成功地构建了酵母双杂交随机肽库。

应用酵母双杂交系统筛选hTNFα特异性结合肽

Tumor necrosis factor (TNF) is a key cytokine in immunology system and is well known to be related with many human diseases. In order to inhibit the activity of TNF, a screening protocol was set up and 5 specific hTNFα binding peptides were obtained from yeast two-hybrid random peptide library, which lay a solid foundation for the further large scale screening and application.

应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的 :应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem10 4相互作用的蛋白 ,为该基因的功能研究提供线索。方法 :构建AngRem10 4的真核表达载体AngRem10 4 pGBKT7/c myc,转化酵母菌AH10 9,Westernblot证实蛋白表达 ,进行毒性和自激活检验 ,与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,筛选与AngRem10 4相互作用的蛋白。结果 :AngRem10 4蛋白能在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子 1α1、糖皮质激素受体AF 1特异延伸因子、β2 微球蛋白、巴戴 -比德尔综合征 2蛋白及 4个与细胞代谢有关的蛋白。结论 :AngRem10 4可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢 ,并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem10

应用酵母双杂交系统筛选与新基因nelin相互作用的蛋白质

目的 通过筛选能够与新基因nelin的心肌特异表达产物相互作用的蛋白质从而揭示nelin的生物功能。方法 构建表达nelin阅读框全长的诱饵质粒并利用酵母双杂交系统筛选人心脏cDNA文库, 以寻找与nelin蛋白发生相互作用的蛋白质。并利用生物信息学方法对筛选得到的蛋白质进行功能结构域分析。结果 筛选得到3 个蛋白质分别为肌联蛋白 (Titin ) N2B亚型, 细丝蛋白 (Filamin ) C亚型即γ Filamin和α胰蛋白酶抑制物重链前体 (inter alphatrypsin inhibitor heavy chain precursor, ITIH)。对这3种蛋白的C末端结构域进行分析发现Titin和Filamin均含有免疫球蛋白样结构域 (Ig- like domain)。结论 实验结果揭示了新基因nelin很可能表达一个细胞骨架相关蛋白, 它可通过其蛋白质的C末端同Titin和Filamin的免疫球蛋白样结构域发生相互作用而参与细胞骨架网络的形成。

酵母双杂交随机肽库的设计及构建

目的 构建一个含 16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库。方法 设计合成编码 16肽的随机DNA片段 ,PCR扩增随机DNA片段 ,经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH RP并检验其库容。结果 扩增获得编码 16肽的随机DNA片段 ,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,与GAL4AD形成融合蛋白 ,其库容为 1 2 8× 10 7。

利用酵母双杂交系统筛选IRR的结合蛋白

由于 型糖尿病病人对胰岛素不敏感 ,胰岛素受体相关受体 (IRR)的配体将对这些病人具有潜在的治疗作用。构建了以 IRR为筛选靶位的诱饵质粒 ,并利用酵母双杂交系统进行初步筛选 ,在筛选过程中考察氨基三唑(AT)浓度对转化子的影响。经过初筛复筛得到了 1个阳性转化子 ,测定这段 c DNA的序列并通过 Gen Bank搜寻 ,发现它编码的一段开放读框 (ORF)和δ-氨基乙酰丙酸脱水酶基因 (HEM2 )具有一定的同源性 。

随机序列八肽库的构建及其在双杂交系统中的应用

目的:构建一个随机序列八肽库并从中寻找非天然的具有药用价值的多肽。方法:利用基因工程技术构建随机序列八肽库,首先设计并合成了含8个密码子的随机寡核苷酸链,摸索了变性温度与时间、复性温度与时间、延伸温度与时间以及循环数后利用PCR扩增了这一片段,并解决了片段回收、连接等步骤,最后比较了不同的转化方法,采用最简便高效的TSS法转化大肠杆菌建立了随机序列八肽库。结果:利用作者所建立的随机序列八肽库应用于酵母双杂交系统并从中筛选到了一段感兴趣的多肽。结论:随机序列八肽库构建成功并且具有应用价值。

应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质

用NAP1作为"诱饵"蛋白,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,鉴定阳性克隆;再利用酵母双杂交和免疫共沉淀验证相互作用.结果表明,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,阳性克隆的鉴定,发现了与NAP1的相互作用蛋白质―蛋白酶体α亚基3(PSMA3).免疫共沉淀(Co-IP)结果证实外源表达的NAP1蛋白和PSMA3蛋白在293T细胞中有特异性的相互作用.NAP1作为FDC分泌的一种多肽,与PSMA3有特异性的相互作用,这种相互作用如何实现对蛋白酶体降解靶蛋白的活性调节,其作用机理有待深入研究.

以酵母双杂交系统筛选与N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅲ相互作用的蛋白质

用N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅲ(GNTⅢ)作诱饵,以酵母双杂交系统从胎肝cDNA文库中筛选到一种能与N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅲ发生相互作用的蛋白质。与GNTⅢ作用的是早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF),是属于视黄酸受体家庭的一种转录因子。根据这个结果和已有的一些背景理论知识,本文提出了一种新的相互作用假设模型:PLZF是GNTⅢ的底物之一。这种相互作用是已知蛋白间的未知相互作用。

酵母双杂交系统及其应用

酵母双杂交系统（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）是直接于细胞内研究蛋白质间相互作用的一种灵敏度很高，且非常有效的遗传学方法，在不同研究领域中广泛应用，并不断完善及改进，发展出单杂交系统（ｏｎｅ－ｈｙｂｉｄ ｓｙｓｔｅｍ） 和三杂交系统 （ｔｈｒｅｅ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）等一系列相关的技术，克服了原系统的局限。本文对双杂交系统的原理、发展概况、应用、存在问题和前景等进行了综述。

利用酵母双杂交筛选与DAT1的LIM2相互作用的蛋白质

目的 利用酵母双杂交系统筛选人胎脑组织中能与多巴胺相关转录因子DAT1的LIM2相互作用的蛋白质, 以初步了解DAT1的功能。方法 构建酵母双杂交诱饵质粒pLexA-LIM2,筛选人胎脑cDNA文库,并用酵母交配试验初步 验证。结果 获得3个能与DAT1的第2个LIM结构域LIM2结合的相互作用蛋白,通过酵母结合试验证实了它们在酵母 中的结合。结论 DAT1的第2个LIM结构域LIM2可与唐氏综合征关键区基因2(SimilartoDownsyndromecriticalregion gene2,DSCR2)、钙 整合素结合蛋白(calciumandintegrinbindingprotein,CIB)、和HSPC170(CD34+hematopoieticstem/progenitor cells,HSPCs)结合。

酵母双杂交系统

酵母双杂交系统是研究细胞内蛋白质之间相互作用的一种分子遗传学技术,用已知的蛋白质作为诱饵来筛选其可以相互作用的伙伴蛋白。本文简要叙述了酵母双杂交系统的原理、基本方法,以及这个技术的发展和应用。

大规模的酵母双杂交系统在蛋白质相互作用组图谱中的应用

蛋白质-蛋白质之间的相互作用是蛋白质发挥其功能的重要途径之一。通过研究蛋白质组中所有蛋白质之间的相互作用做出蛋白质相互作用对图谱是功能基因组时代许多科学家关注的问题,而大规模的酵母双杂交系统是蛋白质相互作用对图谱的研究中应用较为广泛的策略。近两年来该策略最具代表的实例是用它进行酵母中所有蛋白之间相互作用的检查。但是巨大的蛋白质网络比我们想象要大得多,单一的双杂交系统不能解决所有问题,需要同其它的方法有效地结合。

双杂交系统筛选与AID相互作用蛋白的初步研究

AID(APPintracellulardomain)是由淀粉样前体蛋白APP经γ分泌酶切割产生的胞内端,它可能参与细胞凋亡,基因转录等活动,并对阿尔茨海默氏症的形成有一定影响.为进一步研究AID的功能,在本实验中,我们用AID为诱饵蛋白,运用酵母双杂交系统筛选与其结合的蛋白,得到其中两个阳性克隆,一个为RPS21,另一个为FLJ20551.接着又在酵母体系用β半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用,并在哺乳动物细胞中用免疫共沉淀的方法再次验证了它们相互作用的特异性.这些结果表明RPS21和FLJ20551可能通过与AID相互作用而影响阿尔茨海默氏症的形成.

双杂交系统:新兴的检测蛋白——蛋白交互作用的有力工具

蛋白——蛋白交互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）是生命活动持续的最基本的根据，细胞内的信号传导也是研究细胞的发育、分化及疾病的生理反应所要了解的最终目标。国际上出现了一种直接于细胞内检测蛋白——蛋白交互作用且灵敏度很高的遗传学新方法，酵母双杂交系统（ｙｅａｓｔｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ），可迅速鉴别新的信息传递蛋白。本文综述了双杂交系统的原理、发展概况、应用范围及需注意的一些问题，并对它将来的发展及应用作了一些展望。

利用酵母Two-hybrid系统筛选编码产物与p53相作用的人类基因

用酵母ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ系统在人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中寻找编码产物与ｐ５３相互作用的基因。在１．５×１０６个转化子中筛选到６８个初级阳性克隆。通过测定转化子第二轮β－半乳糖苷酶活力发现，人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中有一个阳性克隆中的ｃＤＮＡ编码产物与ｐ５３反应结果为明显阳性，说明两个蛋白之间存在较强的相互作用。用热测序法测得这段ｃＤＮＡ的序列通过查询基因数据库发现，这段ｃＤＮＡ编码人的泛肽交联酶，可认为是泛肽交联酶参与ｐ５３在细胞内浓度的调节。

NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用多肽的筛选及功能鉴定

目的以NF-κB p65亚基DNA结合域为诱饵蛋白,筛选能够与其发生相互作用的多肽,并鉴定这些多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。方法首先利用PCR搭桥扩增方法获取NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,后将其克隆到酵母双杂交pGBKT7DNA-BD载体上,与GAL4DNA-BD融合,形成GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白;再以GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白为诱饵蛋白行酵母双杂交实验,自16肽随机肽库中筛选与NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用的多肽;最后选择性人工合成筛选获得的多肽,并进行EMSA实验检测相互作用多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。结果扩增获得了NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,并成功构建pGBKT7DNA-BD/p65BD载体。自1.28×107个酵母转化子中最终筛选获得5个阳性克隆,测序结果和同源氨基酸序列比对表明5个阳性多肽为p65BD新型相互作用多肽,其中4条多肽拥有一个共同的基序。EMSA实验结果表明合成的两条多肽对NF-κB的DNA结合活性均具有一定的抑制效应。结论经初筛、复选和假阳性鉴定,自16肽库中获得5个能与NF-κB p65亚基发生相互作用的新型多肽,并已证实其中两条多肽对NF-κB的DNA结合活性具有抑制效应。

NF-κB p50亚基同源结构域相互作用多肽的筛选

目的:应用酵母双杂交技术筛选获得与核因子κB(NF-κB)p50亚基同源结构域(RHD)相互作用的多肽。方法:应用酵母双杂交技术,以NF-κB p50 RHD为诱饵,筛选16肽cDNA文库,寻找与其相互作用的多肽,应用β-gal试验、酵母交配试验及一对一酵母回复性杂交等方法筛除假阳性克隆,确定阳性克隆。结果:经酵母双杂交及反复的排查,共获得8个阳性克隆。通过GenBank进行检索,未发现与之相匹配的蛋白序列。结论:获得8个与NF-κB p50 RHD相互作用的新型多肽,多肽的功能需进一步验证。

巨噬细胞移动抑制因子活性抑制肽的筛选和鉴定

目的:巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitoryfactor,MIF)参与了多种病理生理过程,如多种类型的感染以及关节炎、肾小球肾炎等自身免疫疾病以及动脉粥样硬化的发生、形成过程.本文将利用酵母双杂交技术从预制随机肽库中筛选能有效抑制MIF活性的多肽,为研制MIF活性抑制剂提供候选分子.