平菇漆酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

采用RTPCR技术克隆到一个平菇(Pleurotusostreatus)漆酶基因的全长cDNA,命名为lccPo1,其序列提交GenBank,登录号为AY450404。将其ORF克隆到毕赤酵母表达载体pHBM906,转化3株毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168,该漆酶基因在3种毕赤酵母菌株中均实现了分泌表达。3种摇瓶培养条件①25℃,1.0%(VV)甲醇;②20℃,1.0%(VV)甲醇;③20℃,0.5%(VV)甲醇,进行比较研究后发现适当提高甲醇浓度有利于漆酶在低温条件下表达,而降低培养温度到20℃则可以提高漆酶的产量2～6倍。3株重组毕赤酵母在其最适反应条件下测得三者粗酶液最高漆酶酶活分别为3.19UmL[GS115(pHBM565)]、2.56UmL[KM71(pHBM565)]和2.49UmL[SMD1168(pHBM565)]。对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为4.2,最适反应温度约为60℃。重组毕赤酵母GS115(pHBM565)所产酶的热稳定性稍好,在pH稳定性方面三者没有太大差异。

人Tumstatin在毕赤酵母中的表达和活性分析

利用PCR技术从重组质粒pET-3c-tum中扩增人tumstatin的cDNA片段,连入pPICZαA酵母表达载体,获得的重组质粒pPICZα-tum电激法转化毕赤酵母GS115。经表型鉴定、诱导表达筛选,得到可分泌表达人tumstatin的重组酵母转化子,表达蛋白质的相对分子量约30kD,表达量约25mg/L。表达上清经超滤浓缩和离子交换法初步纯化,所得产物具有免疫活性,能够抑制内皮细胞增殖,诱导其发生细胞凋亡,并能抑制鸡胚尿囊膜血管生成。

基因调控网络建立的生物动力学方程研究

目的基于基因表达的时空特性,寻求一种新的描述基因调控网络的生物动力学方程模型。方法从生物物种竞争动力学系统的角度出发,提出一种新的Lotka-Volterra微分方程模型,并应用于基因的时间序列表达数据。结果将建立的微分方程应用于酵母基因的表达调控网络研究,得到了调控关系的预测结果,并与试验结果进行了比较研究。结论本研究的预测结果与试验结果基本吻合,该模型弥补了其他模型的不足,是一种新的有价值的基因表达时空微分方程模型。

酵母表达鲑鱼降钙素的降血钙活性和药动学研究

目的:研究表达鲑鱼降钙素的转基因酵母(yAGA2-r-sCT)的降血钙活性及在大鼠体内的药动学特征。方法:Tsuruo-ka法制备高钙血大鼠模型,观察给药后血浆钙浓度的变化。随机分组单剂量给药试验设计单剂量灌胃yAGA2-r-sCT0.5g.kg-1和肌肉注射密钙息(Miacalcic,Mia)100IU.kg-1进行药物代谢动力学研究,酶联免疫吸附法测定各时间点血药浓度,DAS2.0药动学软件计算出相应的药动学参数,t检验比较2种制剂的药动学参数。结果:灌胃yAGA2-r-sCT0.5及1g.kg-1,静脉注射帕米磷酸二钠(pamidronate,Pam)5mg.kg-1,肌肉注射Mia100IU.kg-1均有明显降低血浆钙浓度的作用,经配对t检验,三者用药后1h的血钙变化率差异无显著性(P>0.05)。四参数回归方程为OD=-7×10-7C3+3×10-4C2+7.3×10-3C-0.0761(r=0.9985),检测范围为5～200μg.L-1,最低检测限为5μg.L-1,日内和日间RSD小于8.6%;单剂量灌胃yAGA2-r-sCT、肌肉注射Mia,Tmax分别为(3.00±0.58)和(1.00±0.29)h,Cmax分别为(106.00±21.17)和(132.00±27.15)μg.L-1,T1/2α分别为(2.29±0.39)和(0.08±0.21)h,T1/2β分别为(3.86±0.67)和(2.49±0.52)h,Ka分别为(0.43±0.22)和(13.99±0.43)h-1,AUC0-t分别为(797.13±134.13)和(598.0±116.33)μg.h.L-1,AUC0-∞分别为(858.56±160.18)和(621.84±125.60)μg.h.L-1,MRT0-t分别为(5.44±1.11)和(4.26±0.70)h,MRT0-∞分别为(6.59±1.17)和(4.89±1.11)h,说明yAGA2-r-sCT与市售Mia在大鼠体内的药动学特征差异具有显著性(P<0.05或0.01)。结论:yA-GA2-r-sCT可显著降低血钙。酶联免疫吸附法测定鲑鱼降钙素含量的方法稳定,结果准确可靠。yAGA2-r-sCT与市售Mia相比,yAGA2-r-sCT显著改善了鲑鱼降钙素的药动学性质,具有缓释和长效的作用。