猪C型凝集素受体8A骆驼单域抗体酵母展示文库的构建

为构建猪C型凝集素受体8A（C-type lectin domain family 8，member A，CLEC8A）的单域抗体酵母展示文库，本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析，鉴定出该受体胞外区基因序列，并插入原核表达载体pET28a（＋），在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出了猪CLEC8A胞外区蛋白。表达的蛋白经201佐剂乳化后免疫双峰驼，间接ELISA监测抗体滴度，于六免后15d分离骆驼外周血淋巴细胞。提取总RNA，反转录成cDNA后经巢式PCR扩增获得骆驼WfH基因。纯化的VHH片段与线性化的pCTCON2载体混合后共转入酿酒酵母感受态细胞（EBY100），经细胞内同源重组，成功制备了针对猪CLEC8A受体的骆驼单域抗体酵母展示文库。经菌落计数及测序鉴定结果表明，文库大小约为1．6×10 7，文库重组率达90％，文库多样性丰富。流式细胞术初步鉴定酵母细胞表面成功展示出抗猪CLE8A的单域抗体，为后续文库筛选奠定基础。

利用酵母随机展示技术对猪肺炎支原体P97上B细胞表位的筛选和鉴定

构建猪肺炎支原体P97蛋白的酵母随机展示文库,并利用该文库筛选和鉴定P97蛋白上的特异性B细胞表位。设计特异性引物从Mhp基因组中扩增p97基因,通过PCR方法将基因内部的TGA密码子突变为TGG,用DNaseⅠ将p97突变基因随机消化成长度100~250bp的片段,回收产物经3′端加A处理后与用XcmⅠ酶切的酵母表达载体pCT-XcmⅠ连接,将连接产物转化酿酒酵母EBY100获得P97蛋白酵母随机展示文库。利用流式细胞分选技术筛选出文库中能与Mhp天然感染的猪阳性血清结合的阳性酵母克隆,并进一步鉴定其最小抗原表位。结果:1)克隆计数显示构建的随机文库库容量为2.86×106克隆,所有插入的片段随机分布,覆盖了全长的p97突变基因,文库经诱导后可以利用流式细胞仪检测到与Mhp天然感染的猪阳性血清反应的阳性克隆;2)随后对文库进行流式细胞分选,经鉴定选出184号一个抗原多肽。从短肽C端氨基酸逐个缺失后发现长度为15个氨基酸的184D(DEKTSSQKDPSTLRA)多肽为一个B细胞表位,该表位能与多份Mhp阳性猪血清反应。P97蛋白酵母随机展示文库可以用于抗原表位的筛选鉴定,184D多肽是P97上一个在宿主体内能普遍诱导抗体免疫应答的B细胞表位,本研究对于研发Mhp的表位疫苗和建立特异性诊断方法具有重要意义。

利用酵母随机展示文库筛选与鉴定基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白B细胞抗原表位

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)给全世界家禽养殖业造成了严重的经济损失。HN蛋白是NDV上的重要囊膜蛋白,能诱导鸡体内的免疫系统产生保护性抗体。为了鉴定HN蛋白上的B细胞表位,本研究成功构建了基因Ⅶ型NDV HN蛋白的酵母随机展示文库,该文库的库容量为5×10^5 CFU,插入的片段随机分布。利用NDV高免血清标记HN蛋白的酵母随机展示文库,然后通过流式细胞分选技术分选阳性克隆细胞进行测序分析。结果显示,阳性文库中150号多肽(GAPVHDPDYIGGIGKE)含量很高。对150号多肽进行截短分析,结果表明该多肽中VHDPDYIGGI序列为最小的B细胞表位,该表位能与感染NDV的高免血清普遍反应。因此,VHDPDYIGGI多肽是基因Ⅶ型NDV HN蛋白中广泛存在的B细胞表位。本研究结果为将来开发新城疫新型ELISA检测试剂盒以及表位疫苗奠定了基础。