青蒿二烯功能模块与酵母底盘的适配性

设计构建人工酿酒酵母细胞合成青蒿二烯的关键是使外源功能模块与底盘细胞适配,本文通过对外源功能模块中的载体、蛋白表达和启动子进行优化,以提高功能模块与底盘细胞的适配性.使用着丝粒载体和附加型载体构建了2种青蒿二烯功能模块,在过表达甲羟戊酸(MEV)途径中关键基因(截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMGR及法尼基焦磷酸合酶基因ERG20)的2种酵母底盘中进行适配,得到适配性较好的人工合成细胞,其产量为11.2 mg/L;将青蒿二烯合酶基因(ADS)与ERG20进行融合构建融合蛋白功能模块,在选定底盘中适配性进一步提高,青蒿二烯的产量提升至17.5 mg/L;采用不同强度的启动子(TDH3p,TEF1p和PGK1p)对融合蛋白功能模块进行调控,最终得到功能模块与底盘间适配关系更好的人工合成细胞,其产量提升到71.8 mg/L.

诱导型和组成型启动子对酿酒酵母合成紫杉二烯的影响

近年来利用合成生物学手段生产萜类化合物逐渐成为一种趋势。诱导型和组成型启动子调控萜类的生产各有利弊,而启动子类型的选择需要根据特定体系和产物来进行具体分析。本工作针对紫杉醇关键前体紫杉二烯的合成,分别研究了酵母细胞中诱导型启动子和组成型启动子的调控。首先通过过表达酵母内源截短的羟甲戊二酰辅酶A基因(thmgr)和法尼基焦磷酸合酶基因(erg20),实现了对酵母内源模块的调控。随后向改造后的底盘细胞中整合入诱导性启动子调控的外源紫杉二烯合成模块,得到了紫杉二烯产量为5.2mg·L-1的人工酵母。而换用组成型启动子tdh3p调控时,产量达到11.5mg·L-1,说明对于这个体系组成型启动子更为适合。通过简单的发酵条件优化,该菌株产量提升了70%,达到19.5mg·L-1。组成型启动子调控的菌株可以利用葡萄糖作为碳源,因而更利于后续大规模发酵。

工程酵母助力真菌嵌合萜类合酶的快速系统挖掘

真菌特有的嵌合萜类合酶(简称为PTTS)由C端异戊烯基转移酶(PT)结构域和N端I型萜类合酶(TS)结构域组成,可直接催化异戊二烯单元产生结构多样的二萜和二倍半萜化合物。自2007年发现第一个PTTS以来,只有约20个PTTS的功能被验证,人们对PTTS的起源和功能进化的认识还十分有限。最近武汉大学刘天罡教授课题组与美国田纳西大学陈峰教授课题组合作,运用高效萜类前体供给的酿酒酵母底盘并结合高通量的自动化平台,对PTTS的起源和功能进化进行了深入系统的探索,扩充了嵌合萜类合酶家族成员的数量,并为萜类化合物的挖掘提供了一个高效的方法。