酵母染色体指纹图谱鉴定酵母菌种的研究

脉冲电场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis)简称PFGE技术,是一种新发展起来的电泳技术.该技术在琼脂糖凝胶中用电泳分离完整的酵母染色体DNA分子,从而估算酵母细胞染色体条数及每条染色体DNA分子的大小,这种方法被称为电泳核型分析(electrophoretic karyotying)或分子核型分析(molecular karyotyping)或酵母染色体指纹图谱分析(chromosome fingerprinting).本文通过优化提取染色体的实验条件,分析了上面酵母与下面酵母染色体指纹图谱的差异性;分析了国内几家啤酒生产企业酵母染色体指纹图谱的差异性;同时探讨了染色体指纹图谱技术的进一步拓宽应用--野生酵母污染的检查和监控生产用菌株的稳定性,该技术可以满足啤酒生产企业进一步对产品质量稳定性与产品特色性控制的要求.

酿酒酵母染色体设计与合成研究进展

随着合成生物学的蓬勃发展,基因组学的研究正在由读取基因组信息拓展到以编写基因组信息为主的合成基因组学时代。2009年,由Jef D.Boeke教授提出的人工合成酵母基因组计划(Sc2.0)旨在合成世界上首个真核生物基因组。在美、中、英、法、澳大利亚、新加坡等多国科学家的努力下,目前已经完成1/3的酵母染色体的人工合成。本文从合成基因组学领域的发展历程出发,介绍了Sc2.0计划中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色体设计与合成的最新进展,包括酿酒酵母9号染色体右臂、3号染色体、2号染色体、5号染色体、6号染色体、10号染色体和12号染色体的设计与合成过程,阐述了其各自的合成策略以及生物学意义,以期为合成基因组学的深入开展提供借鉴与参考。

部分抗肌萎缩蛋白基因酵母人工染色体物理图谱

酵母人工染色体《Yeast Attificial Chromosome，Hc)是近年发展起来的大容量克隆载体，可容纳数十万乃至上百万碱基对的DNA大片段，对克隆巨大基因和绘制大尺度物理图谱具有显著的优越性。抗肌萎缩蛋白基因是迄今发现的人类最大基因，长约：2300kb．该基因的异常，

利用同源重组对酵母人工染色体左右臂进行多基因修饰

构建携带哺乳动物细胞筛选基因和酵母人工染色体(YAC)同源序列的载体,利用酵母中能够发生高频率同源重组的特点对YAC分别进行左、右臂修饰,依次将NEO、EGFP及PURO基因定点整合到YAC左右臂上。用营养缺陷筛选的方法排除酵母发生突变或随机整合等情况后,用PCR及Southern杂交方法证实各筛选基因定点整合于YAC两臂上,从而获得携带3个哺乳动物细胞筛选基因的YAC克隆。并且由此建立了通过同源重组将哺乳动物标记基因定点引入YAC左右臂的多基因修饰平台。

酵母人工染色体载体的改造和修饰

将能在植物中表达的烟草花叶病毒ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、ＧＵＳ基因、潮霉素（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）基因及ＮＯＳ终止子组建到酵母人工染色体（ＹＡＣ）载体，构建了具有能在植物细胞中表达和选择ｐＹＡＶ、ＧＵＳ、ｐＪＳ９７／ｐＪＳ９８－ＨＹＹＡＣ载体系统和一个标记ＹＡＣ克隆的ｐＵＲ４３－ＨＹ质粒。

利用酵母人工染色体(YAC)减数分裂同源重组构建人免疫球蛋白κ链基因组大片段

具有同源重叠区的酵母人工染色体(YAC)可以利用酵母细胞减数分裂进行同源重组,从而构建更大的人工染色体基因组,这对生命科学基础研究和生物技术应用研究有着非常重要的意义。本实验以两个含人免疫球蛋白κ链基因簇片段的YAC克隆为材料,通过酵母改型、异型接合、二倍体发孢、单孢子筛选和分子生物学鉴定等技术和方法,利用酵母菌减数分裂同源重组机制,构建了一条包含人的免疫球蛋白κ轻链32个Vκ基因、5个Jκ基因、Cκ基因、Eκ基因和κde基因的YAC重组体,长度约400kb。同时,本实验利用溶壁酶消化法获取单孢子重组体,代替了传统的显微分孢操作。使得利用酵母人工染色体减数分裂同源重组的技术更加简便可行。

以“末端修饰法”构建人基因组的酵母人工染色体克隆

采用“末端修饰法”修饰酵母人工染色体（YAC）载体与基因组插入片段的酶切末端，并优化各个实验参数，成功地得到了4000多个YAC片段的克隆群，转化率为400～500转化子／μgDNA。经随机抽样初步鉴定：80％的阳性克隆能检出人工染色体，插入片段的大小范围为150～750kb，平均为450kb。载体连接实验检测表明，末端修饰法能有效防止“共连接”的发生。

酵母人工染色体转基因研究及其应用

酵母人工染色体 (YeastArtificialChromosome ,YAC)克隆的基因组大片段 (YACs) ,在转基因动物中有与内源性基因相当的最佳表达水平 ,具有位置独立性、组织特异性和拷贝数依赖性的优势 ,在基因的表达调控、人类遗传病的动物模型及生物反应器等转基因研究中占有独特的地位。

转基因动物乳腺生物反应器的发展概况及人工染色体在其中的应用

转基因动物乳腺生物反应器位点效应的影响是制备转基因动物乳腺生物反应器过程中的主要问题。酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)具有容量大的特性,可以将乳蛋白的整个基因座包括所有调控序列全部装载进去,有可能克服位点效应的影响,是一种理想的载体。YAC和BAC载体转基因技术可能成为避开基因打靶获得高效表达的转基因动物乳腺生物反应器的另一途径。

从酵母人工染色体的人基因组片段直接分离表达顺序的初步研究

报导“从酵母人工染色体的人基因组片段直接筛选表达顺序”的方法体系。以定位于人基因组１３ｑ１４．３的ＹＡＣ２７Ｄ０８和人脑。ＤＮＡ分子库为主要研究材料，从１×１０６个ｃＤＮＡ克隆中筛选到５２个阳性克隆。经ＰＣＲ扩增产物Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交分析，排除了３１个假阳性克隆。继而分别用人基因组总ＤＮＡ、酵母基因组ＤＮＡ和人的ｒＤＮＡ为探针作ｄｏｔｂｌｏｔ杂交分析，又排除１８个非特异杂交的克隆，最后得到３个候选ｃＤＮＡ克隆。经与ＹＡＣ２７Ｄ０８以及１０个定位于染色体其他区带的ＹＡＣ克隆作杂交验证，确认这３个ｃＤＮＡ克隆是来自ＹＡＣ２７Ｄ０８的特异性表达顺序。它们被分别命名为ｃｆｄ１３—１，ｃｆｄ１３—２，ｃｆｄ１３—３。其插入片段分别为２．０ｋｂ，１．１ｋｂ和３．８ｋｂ。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析结果表明：ｃｆｄ１３—１和ｃｆｄ１３—２所在基因的转录物分别长９．０ｋｂ，７．０ｋｂ，ｃｆｄ１３—３则出现６条杂交带，分别长１２．０ｋｂ，３．０ｋｂ，２．２ｋｂ，１．５ｋｂ，１．０ｋｂ和０．６ｋｂ。

YAC克隆的筛选及鉴定分析技术

人工酵母染色体（ＹＡＣ）技术是人类基因组分析及疾病相关基因的分离、克隆中的关键技术。在基因组ＹＡＣ文库基础上特定目的基因的分离克隆涉及ＹＡＣ克隆的筛选，嵌合体、缺失体和共转染克隆的检测与处理，插入片段的分离及其结构特征的分析，亚克隆的快速构建等等。近年来，有关技术取得了重要进展，已趋于成熟。

YAC介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移──天蚕丝素基因-YAC克隆在家蚕的表达

本文为天蚕Antheraeyamamai丝素基因在家蚕Bombyxmori成功表达的首次报道。我们构建了天蚕丝素基因的YAC克隆，然后把含有该克隆的DNA溶液导入家蚕受精卵。分子杂交实验证明天蚕丝素基因已整合到家蚕基因组中。通过丝心蛋白氨基酸组分分析以及茧丝的溶解性比较，发现有部分转基因家委表达了天蚕丝素基因。F2代的转基因家蚕蛾的染色体DNA中同时还存在YAC序列，说明YAC对丝素基因具有介导作用。天蚕丝素基因以单拷贝形式存在于转基因家蚕中。

转基因动物技术的研究进展

转基因动物是其基因组内稳定整合了所导入的外源基因的动物。目前转基因实验动物体系的研究 ,主要集中在导入方法和提高整合和表达效率两个方面。本文对这两个方面的进展作一综述。

水稻核基因组DNA的YAC克隆和鉴定

将EcoRⅠ部分消化的水稻(Oryza saliva L.)细胞核高分子量DNA电泳分部,回收大于200kb的片段,与内切酶消化过的酵母人工染色体(YAC)双质粒载体pJS97,pJS98DNA连接,转化酵母YPH252感受态原生质球,用Ura^-,TrP^-双选择培养基直接筛选转化子,已获得2000多个克隆。转化子DNA的Southern杂交显示插入片段在200～820kb范围。

濒危畜禽品种YAC基因组文库的构建

尽管酵母人工染色体 (Yeast artificial chrom osome,YAC)存在着克隆效率低、嵌合体出现率高、部分克隆不稳定和缺失等弊端 ,但由于它容纳高分子量 DNA的优点其它载体无法替代 ,而成为人类和动物基因组研究中最为主要的研究工具之一。因此 ,利用 YAC载体系统构建我国濒危畜禽品种的基因组文库 ,对于在分子水平保存国家重要的基因资源和深入的分子生物学研究等方面 ,均具有非常重要的意义。

动物乳腺组织高效表达通用型YAC载体的构建

以含有人α-乳白蛋白基因功能域的YAC(yeast artificial chromosome)为起始材料，构建了可以在动物乳腺高效表达外源基因的载体系统。根据已发表的人α-乳白蛋白基因序列，通过PCR的方法，扩增出了其5’端的837bp及3’端的1007bp片段，构建了整合型载体pRLA22。利用pRLA22在大肠杆菌中进行基因操作，可以将外源基因准确地置于乳白蛋白基因启动子控制之下。把重组的pRLA22导入含YAC的酵母菌后，高频率同源重组事件将会把外源基因插入YAC。本实验通过上述程序，将鸡的γ-干扰素基因cDNA序列导入了YAC。经过PCR检测，证明鸡的γ-干扰素cDNA序列已被重组到YAC的预定位置。因此，大肠杆菌载体pRLA22和含人的α-乳白蛋白基因的YAC，将构成能在动物乳腺高表达外源基因的有效载体系统。

从YAC DNA制备荧光原位杂交探针的新方法

介绍了一种新的ＹＡＣ ＤＮＡ的回收方法。该方法先用脉冲电泳分离并回收ＹＡＣ条带，然后连接引物用ＰＣＲ扩增ＹＡＣＤＮＡ。这一方法回收的ＹＡＣＤＮＡ一是量多，节省制备探针的时间；二是产物总的染色体跨度大，有利于染色体原位杂交。经ＦＩＳＨ（荧光原位杂交）鉴定证明该方法得到的ＹＡＣＤＮＡ对ＹＡＣ的定位和嵌合的鉴定非常有效。

Xp11.2区域YAC OAT1中表达顺序筛选

筛选 X染色体 Xp11.2区域的酵母人工染色体 ( YAC)克隆 OAT1所包含的表达序列 ,为该区域疾病相关基因的克隆探索方法。以 YAC克隆 OAT1为探针 ,与胎脑 c DNA文库的噬菌体原位裂解膜进行两轮杂交。所得的阳性克隆经过杂交鉴定剔除假阳性克隆和重复序列 ,并进行测序分析。获得了一个 YAC OAT1编码的表达顺序克隆。该克隆与鸟氨酸转氨酶 ( Ornithine Amino-transferase,OAT)

Alu-PCR联合荧光原位杂交技术鉴定bcr基因相关YAC克隆

目的制备慢性髓细胞性白血病（ＣＭＬ）ｂｃｒ基因重排的ＤＮＡ探针。方法应用Ａｌｕ－ＰＣＲ和荧光原位杂交（ＦＩＳＨ） 技术，对３个酵母人工染色体（ＹＡＣ）候选克隆进行鉴定，制备ＤＮＡ探针，并经正常人外周血淋巴细胞和慢性髓细胞性 白血病患者骨髓细胞筛选。结果确定了ＹＡＣ７６５Ｅ３为非嵌合体，定位于染色体２２ｑｌｌ ｂｃｒ基因区域，而且可在Ｐｈ染 色体阳性细胞中易位至９ｑ３４。探针特异性杂交效率达９５％。结论ＦＩＳＨ技术是染色体、染色体畸变鉴定和染色体上特 殊序列定位的重要检测方法。联合应用Ａｌｕ－ＰＣＲ技术特异性扩增载体ＹＡＣ中人类基因组来源的ＤＮＡ制备探针，为慢性髓细胞白血病的诊断和监测微小残留病提供了一个新的手段。

YAC转基因研究进展

ＹＡＣ转基因研究进展成国祥，徐少甫（扬州大学农学院生物技术研究所哺乳动物胚胎工程和扬州大学农学院遗传工程实验室江苏扬州２２５００１）用转基因小鼠从个体水平上研究外源基因表达调控及其功能是很有效的手段。常规转移外源基因技术导入ＤＮＡ的片段小于５０Ｋｂ［...