酵母表面展示系统研究进展

酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立后发展起来的真核展示系统 ,酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似 ,对人的蛋白质表达和展示更具优越性 .酵母细胞颗粒大 ,可用流式细胞仪进行筛选和分离 .目前报道的两种酵母展示系统分别以α或a凝集素作为融合骨架 .在蛋白质的定向进化、口服疫苗的研制等多方面均有报道 .

鲤春病毒血症病毒糖蛋白酵母表面展示系统的建立

糖蛋白(Glycoprotein,G)作为鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus,SVCV)主要的抗原蛋白,已成为现阶段SVCV病毒检测、抗体制备以及疫苗研制的热点。为了对其进行酵母表面展示,研究以SVCVshlj1分离株基因组为模板,通过RT-PCR技术,体外扩增获得SVCV表面糖蛋白的基因开放阅读框(1530 bp)片段,将其克隆至酵母表面展示载体pYD1,构建重组质粒pYD1-G。利用电转化方法将重组质粒pYD1-G导入酿酒酵母EBY100感受态细胞,经YNB选择培养基筛选和菌液PCR的鉴定,挑选出阳性转化子(命名为EBY100-pYD1-G),对其进行2%半乳糖诱导。利用细胞免疫荧光和流式细胞仪检测G蛋白的酵母表面展示情况。细胞免疫荧光结果显示,诱导后的酵母细胞EBY100-pYD1-G能产生特异性红色荧光,且随着诱导时间的增加,红色荧光的酵母细胞所占比例不断增加,各组之间差异显著(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,酵母细胞的荧光强度与诱导时间呈正比,其中诱导48h与72h的酵母细胞荧光强度不存在显著差异,基本趋于稳定不变的状态。因此,选取诱导48h为酵母表面展示的最佳诱导时间。上述研究结果表明SVCV的G蛋白已经成功展示于酿酒酵母细胞表面,研究为鲤春病毒血症酵母口服疫苗的研发奠定了前期基础。

表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母FM22发酵培养基响应面优化

FM22培养基以丰富的氮源、较强的适应性等优势,适用于毕赤酵母发酵。为进一步对毕赤酵母发酵表达南极假丝酵母脂肪酶B进行优化,选取培养基中对其影响较大的CaSO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、PTM4为自变量,酶活力为响应值。通过单因素试验得自变量最佳值及高低水平,再采用Box-Behnken组合设计方法,模拟二次多项式回归方程的预测模型,研究各自变量及其交互作用对酶活力的影响。最终得到自变量最佳值:KH2PO445.02g/L、(NH4)2SO45.63g/L、CaSO40.46g/L、PTM4 1.63mL/L,酶活力为3214.7U/gDCW,较优化前提高约40%。

纤维素结合域的酿酒酵母表面展示及其黏附位点初探

利用酿酒酵母表面展示系统表达产琥珀酸丝状杆菌S85纤维素结合域家族2(CBD2),分析其纤维黏附位点。将CBD2基因插入质粒pYD1的AGA2 3′端,构建pMCBD2重组质粒,化学转化pMCBD2至酿酒酵母EBY100中,2%半乳糖诱导CBD2表达于酿酒酵母表面。利用免疫组化技术检测重组酵母细胞在稻草茎细胞壁上的黏附位点。结果表明:利用酿酒酵母表面展示系统可成功表达产琥珀酸丝状杆菌S85的CBD2基因;重组CBD2的pMCBD2-EBY100与稻草茎孵育后,经抗V5异硫氰酸荧光素标记抗体处理可在稻草茎的薄壁、厚壁和维管组织均检测到荧光。产琥珀酸丝状杆菌S85的CBD2黏附稻草多个组织。结果提示:酿酒酵母表面展示技术与免疫组化技术联用研究瘤胃细菌CBD的黏附位点是可行的。

β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面上的展示及酶学性质的研究

根据裂殖酵母的β-葡萄糖苷酶的基因序列和酒精酵母菌表面展示质粒载体pYD1上的多克隆位点设计引物,从裂殖酵母中提取总RNA,然后反转录扩增得到β-葡萄糖苷酶基因(bglA),把该基因连接到表面展示质粒载体pYD1上,成功构建了重组质粒pYD1-bglA,并转化用于表面展示的酵母EBY100菌株中,得到酵母转化子,提取酵母菌的DNA通过PCR扩增证实了β-葡萄糖苷酶基因已整合到酵母基因组中.以不含载体和含空载体的酵母菌为对照,加2%(w/v)的半乳糖诱导48 h后,利用免疫荧光法在荧光显微镜下检测到了来源于裂殖酵母的β-葡萄糖苷酶展示在酵母菌细胞表面,并对其酶学性质进行分析研究.

热纤梭菌内切葡聚糖酶在酿酒酵母细胞表面上展示研究

[目的]对热纤梭菌内切葡聚糖酶进行酿酒酵母细胞表面展示研究,探索降低纤维素酶成本和提高酶活的方法。[方法]通过提取产内切葡聚糖酶的热纤梭菌总DNA,根据热纤梭菌内切葡聚糖酶基因序列和酿酒酵母表面展示质粒载体pYD1上的多克隆位点设计引物,克隆内切葡聚糖酶目的基因,将其连接到酵母表面展示质粒载体pYD1上,构建重组质粒pYD1-CelA,并将其转化入酿酒酵母菌株EBY100中,经诱导表达后,测定表达产物的最适温度和pH,并分析影响其活性的金属离子种类和浓度。[结果]PCR扩增获得1 400bp左右的内切葡聚糖酶CelA基因片段,并成功构建了该基因与酵母表面展示质粒载体pYD1的重组质粒pYD1-CelA。重组质粒转化酿酒酵母菌株EBY100后,在鉴定培养基上测定透明圈的大小得出最佳诱导时间为60 h。表达产物性质的研究结果显示其最适反应温度为50℃,在pH 4.6时酶活性相对较高。[结论]该研究结果为后续对纤维素酶的进一步研究、改造、大量生产及应用奠定了一定的基础。

D2-43病毒E蛋白在酵母细胞表面的展示

目的 :在酵母细胞表面展示登革 2型病毒 4 3株 (D2_4 3)的E基因 ,探索利用酵母表面展示系统建立DNA改组筛选平台的可行性。方法 :通过RT_PCR扩增获得D2_4 3的E基因 ,将该基因亚克隆至T载体后 ,再克隆至酵母表面展示载体pYD1,于酿酒酵母EBY10 0中利用半乳糖进行诱导表达。表达产物采用间接免疫荧光法和FACS进行检测。结果 :酵母表面展示产物可与D2_4 3的腹水抗体特异性地结合 ;在半乳糖诱导后 2 4h ,展示E蛋白的酵母细胞百分数达 2 2 .0 7%。结论 :本研究为建立基于酵母表面展示系统的DNA改组筛选平台奠定了基础。

人类红细胞膜带3蛋白C端域Lys892～Phe895在Cl^-转运过程中作用的研究

采用酵母表面展示系统 ,表达带 3蛋白膜段结构域 (Gln4 0 4～Val911)至酵母细胞膜 ,功能研究表明 ,表达后的膜段结构域具有离子转运的活性 ,同时 ,带 3蛋白抑制剂 4 ,4′ 二异硫氰 2 ,2′ 二黄酸芪 (DIDS)能够抑制其离子转运的功能 .利用PCR方法 ,以 pFAST Bac mdb3为模板扩增出带 3蛋白膜段结构域的 4种截断突变体 ,分别去除带 3蛋白C端域后 4个 (Ala90 8～Val911)、 16个 (Asp896～Val911)、 2 0个 (Lys892～Val911)、 32个(Asn880～Val911)氨基酸序列 ,测序后将其克隆至表达载体 pYD1上 ,构建酵母表达质粒 pYD1 Trunc4、pYD1 Trunc16、pYD1 Trunc2 0和 pYD1 Trunc32 ,诱导 4组突变体的蛋白质表达 .然后测定Cl-的转运活性 ,结果发现去除后 2 0个 (Lys892～Val911)氨基酸残基后 ,离子转运活性明显下降 ,而去除后 32个 (Asn880～Val911)后 ,离子转运没有进一步下降 ,说明Lys892～Phe895 4个氨基酸残基在带

食品安全快速检测技术获进展

美国《公共科学图书馆一综合》在线报道了乙酰胆碱酯酶酵母表面展示系统的构建及其在有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测中的应用。该成果由中科院上海生科院营养所王慧研究组完成，系统核心技术已获中国发明专利授权，研发的检测试剂盒即将在上海开展示范应用。

中科院上海生科院营养所成功开发食品安全快速检测技术

近日，美国《科学公共图书馆·综合》在线报道了乙酰胆碱酯酶酵母表面展示系统的构建及其在有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测中的应用。该成果由中科院上海生科院营养所王慧研究组完成，系统核心技术已获中国发明专利授权，研发的检测试剂盒即将在上海开展示范应用。

《PLoS综合》：食品安全快速检测技术获进展

近日，美国《公共科学图书馆－综合》在线报道了乙酰胆碱酯酶酵母表面展示系统的构建及其在有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测中的应用。该成果由中科院上海生科院营养所王慧研究组完成，系统核心技术已获中国发明专利授权。研发的检测试剂盒即将在上海开展示范应用。