用壳寡糖修饰的方法提高酵母转化酶的催化活性

为了对来自酵母细胞的天然转化酶分子进行改造,以使其适用于工业和医药领域,利用壳寡糖(COS)对酵母转化酶(YInv)的氨基进行修饰。结果发现:COS修饰后的糖链成功连接到转化酶肽链的氨基上,修饰酶(COS-Inv)的分子量比天然酶(YInv)的明显增大;COS-Inv的催化活性比YInv的提高200.3%。YInv和COS-Inv分子中的多糖含量分别为2.75和6.34 mg/mg。COS-Inv的Km值(58.92 mmol/L)比YInv的Km值(125.45 mmol/L)低得多。YInv和COS-Inv的三维荧光光谱测定结果表明,COS-Inv的荧光强度比YInv的荧光强度低得多,说明COS-Inv与YInv两者的三维分子结构有非常大的差别。由此可见,利用壳寡糖修饰酵母转化酶以改造其分子结构是提高其催化活性的有效办法。

基于网络层次分析法的酵母转化实验策略优化

结合建立的酵母转化实验影响指标体系,利用网络层次分析法(ANP)解决了酵母转化实验策略优化的问题.通过对已有成果进行研究总结,结合前期基础实验以及对该领域专家学者的咨询意见,建立了酵母转化实验影响指标体系,并基于管理学的ANP理论对实验方法进行了两两比较,分析得出电击穿孔为最优酵母转化方法.实验表明,利用脂质体法得到的转化子为31个/μg质粒DNA,利用电击穿孔法在电压为2.0 kV、1.5 kV时得到的转化子分别为37、29个/μg质粒DNA,说明电击穿孔实验转化率相对较高,且电压的改变对转化率影响较大,与指标体系分析结果相符.故该指标体系与分析方法可为毕赤酵母转化实验策略优化提供有效的理论依据,其思路、体系、理论和方法可为同类实验所借鉴.

温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用研究

【目的】探讨不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用。【方法】将4株临床分离菌株分别接种于SDA、PDA、BHI、50mg/kg羊血BHI及5mg/kg GSBHI5种培养基平皿上,每种培养基接种5个平皿,分别置于25℃、35℃、36℃、37℃及38℃含体积百分数为5%CO2的恒温箱中培养。观察菌落生长情况并计算酵母细胞转化率。【结果】在38℃,平皿转化率为25%(只有1株菌发生了转化);在35℃和37℃时,平皿转化率分别是60%和85%;而在36℃时平皿转化率仅为45%。使用50mg/kg羊血BHI和0.5%GSBHI培养基培养,65%培养皿上的菌株发生了酵母相转化,使用BHI培养基培养,45%培养皿上的菌株发生了酵母相转化,而使用SDA和PDA培养基培养,只有20%培养皿上的菌株发生了酵母相转化。37℃时,有3株菌在BHI、50mg/kg羊血BHI和5mg/kg GSBHI培养基上的酵母细胞转化率均达到90%,1株菌在SDA、PDA和BHI培养基上的转化率均低于10%。【结论】温度是影响申克孢子丝菌酵母相转化的关键因素,培养基的营养成分亦是影响转化效果的重要因素。

酵母双杂交表达载体pGADT7-AtTGA2的构建及酵母菌的转化

[目的]研究TGA2在植物系统获得抗性中所起的作用,阐明其作用机制。[方法]通过PCR扩增获得拟南芥中TGA2基因全长CDS序列,克隆至p GADT7酵母表达载体,并转化至AH109酵母菌株中。[结果]重组质粒通过大肠杆菌转化获得了阳性克隆,经过菌落PCR及单、双酶切验证重组质粒构建成功。将重组质粒又转化到AH109酵母菌中,并在相应筛选培养基上成功获得了转酵母菌成功的阳性克隆。[结论]为进一步研究TGA2参与水杨酸诱导抗性基因表达的作用机制奠定了良好的基础。

酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化

NPR1是水杨酸介导的系统获得性抗性(SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子。在SA诱导下,NPR1被转运至细胞核内并与一些转录因子结合,以启动下游基因的表达。本研究通过PCR扩增获得拟南芥中NPR1基因CDS序列,经过限制性内切酶酶切后在T4连接酶作用下分别克隆至pGBKT7与pGADT7酵母表达载体上,并成功将其转化至Gold酵母菌株中。为利用酵母双杂交筛选NPR1参与形成的转录复合体中其它可能存在的蛋白质并阐明其在植物防御信号传导途径中的互作模式奠定了基础。

利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究

综述了毕赤酵母表达系统的优越性、表达受体菌和表达载体、酵母转化、分泌信号、翻译后加工和修饰等特点 ,以及广泛的医用、商业用途 ,在理论研究特别是蛋白质结构与功能方面的潜在应用价值。

核桃翻译起始因子JreIF1A的克隆及抗旱功能分析

真核生物翻译起始因子(eIF1)在逆境响应中具有一定的调节功能。本研究克隆获得核桃(Juglans regia)的1条eIF1A基因(命名为JreIF1A),通过生物信息学、基因表达及酵母转化等不同技术,分析JreIF1A在干旱胁迫下的基本生物功能。结果表明,JreIF1A的开放阅读框为438 bp,编码的多肽含145个氨基酸,分子量为16344.48 u,理论等电点为5.08。JreIF1A与土瓶草(Cephalotus follicularis)、毛果杨(Populus trichocarpa)等的亲缘关系较近。JreIF1A能被干旱胁迫显著诱导,且在根和叶中具有表达特异性。将JreIF1A转入酵母,对转基因酵母INVSC1(pYES2-JreIF1A)及对照酵母INVSC1(pYES2)分别进行干旱(山梨醇,0.2 mol/L)处理,发现INVSC1(pYES2-JreIF1A)在干旱胁迫下的生长活性显著优于INVSC1(pYES2)。表明JreIF1A基因能不同程度地响应干旱胁迫,其表达可有效改善转基因酵母的抗旱响应能力;JreIF1A基因可作为核桃逆境适应机制研究的候选基因。

柳枝稷BiP基因的鉴定、表达分析和抗逆境功能

有害环境条件对植物生长发育有不利影响,并会引起蛋白质变性或错误折叠。分子伴侣之一的绑定蛋白(BiP)通过减轻错误折叠蛋白质引起的内质网应激发挥重要的保护作用。柳枝稷(Panicum virgatum L.)是一种原产于北美、多年生C4型禾本科植物。由于其生物量大、适应性强,近年来被作为能源植物研究和利用。为明确柳枝稷中BiP基因及其在逆境下的表达和功能,本研究通过对柳枝稷基因组数据本地BLAST比对,结合具有BiP保守结构域和内质网驻留信号序列(HDEL)特征筛选的条件,共在柳枝稷基因组中鉴定出4个BiP基因,命名为PvBiP1a、PvBiP1b、PvBiP2、PvBiP3,分别位于1号和5号染色体上。多物种序列比对和进化分析结果表明,PvBiPs具有BiP蛋白典型功能结构域,PvBiP1a和PvBiP1b聚成一个进化枝,并与水稻OsBiP1聚为一类,都含有7个内含子结构;PvBiP2与PvBiP3聚为另一进化枝,无内含子结构。上游2 kb启动子序列分析结果表明,PvBiPs主要包括胁迫防御和激素应答顺式作用元件。PvBiPs受内质网胁迫诱导剂二硫苏糖醇诱导表达,在NaCl、PEG、ABA和CdCl胁迫下表现出上调表达,PvBiP2相对表达量的峰值最高。将PvBiP1a、PvBiP2与PvBiP3克隆至pGAD426载体并转化酵母,在CdCl、NaCl和甘露醇胁迫下进行耐性验证,结果显示,3个基因对镉和盐胁迫都有耐性,对甘露醇胁迫无耐性。本研究结果将为深入挖掘柳枝稷BiP基因功能、提升柳枝稷在逆境下尤其是对重金属镉胁迫的耐性提供理论基础。

蒙古柳cDNA转化酵母菌及NaCl胁迫抗性基因筛选

为挖掘蒙古柳的NaCl胁迫相关基因,本研究利用FOX hunting system技术,构建蒙古柳cDNA连接pYES2载体后转入酵母InVSCI菌株。本研究将pYES2-蒙古柳cDNA酵母菌在1.0 mol/L Na 抗性板胁迫处理后得到15个抗NaCl胁迫的酵母菌株,并利用这15个菌株进一步通过NaHCO3、H2O2和Srobitol抗性进行分析,结果发现都表现出比对照组更强的耐胁迫性。接着对这15个菌株提取细胞DNA后克隆获得蒙古柳cDNA,在NCBI数据库中对测序得到的基因序列进行相似性比对,结果发现大部分和毛果杨基因有高的相似性,其中一些基因已有研究表明和盐胁迫相关。本研究可为挖掘可利用的耐盐基因资源提供依据。

油葵脂肪酸去饱和酶基因HaFAD2-1的克隆与功能鉴定

为研究油葵FAD2-1基因在脂肪酸合成中的催化功能,利用RT-PCR技术,从油葵品种新葵杂4号未成熟种子中克隆HaFAD2-1基因的全长cDNA序列。将该基因序列构建穿梭表达载体pYES2-HaFAD2-1,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中。将重组酵母诱导培养后对其总脂肪酸进行GC-MS分析。结果显示,HaFAD2-1基因编码一个长378个氨基酸的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子质量43 719,等电点(pI)为8.38,具有3个高度保守的组氨酸簇。脂肪酸甲酯气相色谱分析结果表明HaFAD2-1基因在酿酒酵母中获得表达,能将油酸转化为亚油酸,证明克隆得到的HaFAD2-1具有完整的催化功能。

紫苏Pfgpat9基因的鉴定与功能分析

甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT)是三酰甘油(TAG)合成过程中的关键酶。本研究从油料作物紫苏中筛选鉴定得到甘油三磷酸酰基转移酶基因Pfgpat9,并揭示其编码蛋白特征及基因功能。从紫苏转录组数据库中筛选获得gpat9基因片段,以优选品种‘晋紫苏1号’为材料,通过RT-PCR技术克隆获得该基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为Pfgpat9;利用实时荧光定量PCR方法分析Pfgpat9基因在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子(开花后10、20、30、40 d)中的组织表达特性;通过双酶切将紫苏Pfgpat9基因完整的ORF序列连接到酵母表达载体pYES2.0上,将重组质粒转化至野生型酵母菌株INVSc1和缺陷型酵母gat1,并验证该基因的功能。结果显示:紫苏Pfgpat9基因ORF为1116 bp,共编码371个氨基酸,理论等电点pI为8.96,不稳定系数为46.67,亲水性系数为-0.108,是一种亲水性不稳定蛋白。紫苏Pfgpat9基因具有典型的GPAT9功能结构域,包含3个典型的跨膜螺旋区;多序列比对分析表明,紫苏Pf GPAT9蛋白与油橄榄、茶树和向日葵GPAT9蛋白的亲缘关系较近;qRT-PCR分析显示,Pfgpat9基因在紫苏不同组织中均表达,在种子发育不同时期表达量呈先升高后降低趋势,在开花后20 d表达量达到最高;酵母转化结果表明,转Pfgpat9基因野生型酵母和转Pfgpat9基因缺陷型酵母总脂含量均提高,且C16∶0、C16∶1含量均有所提高。研究表明,Pfgpat9基因在紫苏种子油脂合成积累过程中发挥重要作用,这为进一步通过基因工程及转基因技术改良紫苏品质提供了新的方向。

构树转录因子BpbZIP1的鉴定及镉胁迫响应分析

重金属污染不仅影响土壤有效面积,限制植被分布,也会对食物链和人体健康造成危害,其中镉(Cd)污染尤为突出。选择重金属耐受性强的植物应用于尾矿区的土壤修复亟待进行。构树(Broussonetiapapyrifera)是重金属污染土壤的先锋树种,为探明构树响应重金属胁迫的分子机制,本研究从构树中克隆获得1个碱性亮氨酸拉链(basicleucinezipper,bZIP)转录因子(命名为BpbZIP1),对其基本生物信息、Cd胁迫响应及转化酵母的功能进行分析,预测BpbZIP1响应Cd的功能。结果显示,BpbZIP1基因开放阅读框长1713 bp,编码的蛋白含570个氨基酸,分子量为62902.38 Da,等电点为4.62。与拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtbZIP1具有较近的进化关系。在150μmol·L^(-1)CdCl_(2)处理下,BpbZIP1基因能被不同程度的诱导表达,在3 h时BpbZIP1在根中的表达为对照的17.4倍。将BpbZIP1转入酵母能显著提高转基因酵母的抗Cd能力,当浓度高于0.6%时,转基因酵母的生长活力是对照的1.54~1.71倍。以上结果表明BpbZIP1基因能积极响应Cd胁迫,其表达可改善Cd胁迫耐受力,是构树Cd胁迫响应的重要基因。

疫苗

932959用鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗株表达的索氏链球菌抗原融合的大肠杆菌热不稳定毒素亚基 B

中药成分抗真菌机制研究进展

目前,寻找新型抗真菌药物迫在眉睫。已有研究表明,有效中药成分具有良好的抗真菌作用,可能具有应用前景。本文综述了抗真菌中药及其抗真菌的主要机制,涉及干扰物质运输、酵母-菌丝相转化、宿主免疫和氧化还原等方面,为中药及其提取物在抗真菌中的应用提供了一定的指导。