酵母双杂交系统的原理及应用

0引言 蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础.随着分子生物学技术的发展,特别是人类基因组计划的完成,使人类对基因的结构和功能的认识不断加深,但基因编码的蛋白质的功能研究尚是一个难题.酵母双杂交(yeast two hybrid)技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用,该方法建立以来,经过不断的完善和发展,不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用,更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白.

亮氨酸拉链结构蛋白在大肠杆菌重组子中的表达(英文)

酵母转录因子 GCN4是通过亮氨酸拉链 (b ZIP)结构结合 DNA的蛋白质之一 ,当 GCN 4二聚体与 DNA结合时 ,亮氨酸拉链区的 2个单体结合为平行的卷曲螺旋结构 ,而其基区由无规线团结构变为α螺旋 .为探讨亮氨酸拉链蛋白与 DNA的结合机理 ,设计了含有 GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合 DNA的必需氨基酸的折叠片段 ,并将其克隆到 Escherichia coli BL 2 1,讨论了此亮氨酸拉链蛋白的表达条件 .在蛋白质的小量表达试验中 ,重组子 Es-cherichia coli BL 2 1于 5 m L含有 5 0μg/m L氨苄青霉素和 34μg/m L氯霉素的 L B液体培养基中培养至对数期 ,加入不同浓度的 IPTG,继续培养以诱导蛋白质的表达 ,在不同的时间 (如 :诱导前 ,诱导 2 ,4 ,6 ,8h)取样 10 0μL到1.5 m L离心管中、离心收集沉淀 ,将沉淀悬浮于样品缓冲液中 ,用 10 % SDS- PAGE检测 ;在 10 L含氨苄青霉素和氯霉素的 L B液体培养基中进行了大量表达 ,根据小量表达的试验结果确定了 IPTG的浓度和诱导时间 .结果表明 :含有这种拉链蛋白质的重组子 Escherichia coli BL 2 1在 37℃下小量培养时 ,0 .1～ 0 .8mm ol的 IPTG均可在 2～ 10 h内诱导该蛋白质表达 ;而大量培养时 ,0 .2 m mol和 0 .4 mm ol的 IPTG在 37℃均不可能诱导表达 ,只在2 8℃时才表达 ;

色氨酸标记的GCN4单体肽与DNA位点的分子识别

酵母转录激活因子GCN4调控细胞中氨基酸的生物合成,是典型的含bZIP结构域的DNA结合蛋白.本文合成了天然蛋白GCN4的碱性区(226-252),并在其N末端引入色氨酸残基W,做为单体肽GCN4-W.圆二色(CD)实验表明,突变后的单体肽仍能序列特异性识别DNA结合位点AP-1和ATF/CREB.用荧光滴定方法获得了GCN4-W与DNA位点结合形成复合物的表观解离常数.