产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌聚合酶交联螺旋反应快速检测方法的建立

为建立一种快速检测产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌(emetic Bacillus cereus)的新型、敏感且可视化的聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)方法,本实验根据该菌结构性合成酶基因cesB设计特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,初步建立了检测emetic B.cereus的PCLSR方法。结果显示,PCLSR方法在64℃反应50 min、dNTP浓度为0.3 mol/L、Bst聚合酶浓度为8 U/管时获得最佳扩增效果。以5株emetic B.cereus和12株临床常见菌的DNA作为模板,经本研究建立的该PCLSR方法检测,结果显示,PCLSR法能有效检测5株emetic B.cereus,而对其他相关细菌的检测结果均为阴性,表明该方法特异性较强。将emetic B.cereus 10倍倍比稀释(1×10^(7)cfu/mL~1×10^(0)cfu/mL)后采用该PCLSR法、LAMP法和荧光定量PCR(qPCR)方法检测,结果显示,PCLSR法和qPCR方法的检测限均达1×10^(2)cfu/mL,LAMP法的检测限为1×10^(3)cfu/mL,表明本研究建立的PCLSR法的敏感性较高。采用“国标”中的细菌培养法、PCLSR法、qPCR法及环介导等温扩增(LAMP)法同时检测50份人工污染emetic B.cereus的饲料及灭菌牛奶样品,结果显示,PCLSR法与qPCR法检测emetic B.cereus的阳性率为30%(15/50),阴性率为70%(35/50),二者的符合率均达100%;细菌培养法和LAMP法检测emetic B.cereus的阳性率为24%(12/50),阴性率为76%(38/50),二者与PCLSR法的总符合率均为80%。综上所述,本研究建立的PCLSR法具有较强的特异性、较高的敏感性,且不需要复杂设备和昂贵试剂即可在短时间内完成对emetic B.cereus的检测,该方法的建立为基层部门对emetic B.cereus的检测及该菌的流行病学调查提供了新的技术手段。

复合蛋白酶交联酶聚集体制备枸杞蛋白多肽

该研究利用交联酶聚体技术制备出复合蛋白酶交联酶聚体固定化酶,以酶活回收率为指标,通过单因素实验得到复合蛋白酶交联酶聚集体最佳制备条件:风味蛋白酶与木瓜蛋白酶比例为3∶1,沉淀剂硫酸铵浓度为60%,戊二醛浓度0.5%,交联时间为50分钟,交联pH为7.5。此时最大酶活回收率为80.32%。相比单一蛋白酶,复合蛋白酶交联酶聚集体具有更好的热稳定性和pH稳定性,同时表现出良好的连续多次水解枸杞蛋白的性能。以蛋白水解度为指标,优化后复合蛋白酶交联酶聚集体最佳水解条件为:温度为60℃,pH为6,酶浓度为10 mg/mL,水解时间为100 min,在此条件下枸杞蛋白水解度为41.21%,比游离复合蛋白酶提高了6.9%。

一种基于儿茶素的多酚氧化酶交联聚集体制备及其高效催化合成茶黄素-3,3’-双没食子酸酯研究

为了更加高效低成本地制备茶黄素,以儿茶素作为多酚氧化酶蛋白的交联试剂,对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的多酚氧化酶进行了酶交联聚集体的制备并应用于茶黄素-3,3’-双没食子酸酯的合成。通过对酶交联参数优化以及交联前后的酶催化性能研究,结果表明,在pH 4.0,EGCG为0.5 mg·mL^(-1),多酚氧化酶活性200 U·mL^(-1),交联时间50 min时,可以获得交联酶的最佳酶活回收率。与游离酶相比,交联酶表现出更优异的催化性能(热稳定性、有机溶剂耐受性、底物耐受性)。交联酶被用于合成茶黄素-3,3’-双没食子酸酯时,产物质量浓度可达800μg·mL^(-1),且交联酶能被重复循环使用至少3个批次,利用该方法制备茶黄素,可以显著降低酶的应用成本,具有潜在工业化应用价值。

多酚氧化酶交联β-酪蛋白的抗原性变化初步研究

利用多酚氧化酶催化牛乳β-酪蛋白交联,并通过ELISA方法检测交联前后β-酪蛋白抗原性的变化。SDS-PAGE结果显示,多酚氧化酶可以有效地催化β-酪蛋白交联。同时,间接竞争ELISA检测的β-酪蛋白交联后的半抑制浓度(IC50值)由2.63μg/mL变为4.07μg/mL,表明交联后β-酪蛋白抗原性明显降低。本研究工作为通过多酚氧化酶交联制备低致敏性乳制品提供了部分理论依据。

超声处理对转谷氨酰胺酶交联乳清分离蛋白的结构特性和凝胶保水性的影响

本文研究了超声处理(20 k Hz,400 W,0、10、20、30、40 min)对转谷氨酰胺酶(TGase)交联乳清分离蛋白(WPI)的分子量分布、粒径分布、荧光强度、表面疏水性和凝胶保水性的影响。结果表明,TGase交联WPI后生成了分子量约为120 k Da的大分子聚合物,且聚合物的量随着超声处理时间的增加而逐渐增加; TGase交联WPI后的荧光强度高于未交联的WPI,且荧光强度随着超声处理时间的增加而增大; TGase交联后WPI的表面疏水性增大,且随着超声处理时间的延长,表面疏水性逐渐升高。此外,WPI的粒径随着超声处理而减小,但TGase交联后WPI的粒径明显高于未交联的WPI。TGase交联后WPI的凝胶保水性呈上升趋势,并且随着超声时间的延长而逐渐升高。因此,TGase交联WPI可以改变WPI的结构,增强其凝胶保水性。

生物还原响应的酶交联可注射水凝胶

可注射水凝胶作为生物材料被广泛用于生物医学领域.合成了含有二硫键的葡聚糖衍生物(Dex-SS-PA),使用辣根过氧化酶化学交联制备出新型的生物还原响应的可注射水凝胶.系统研究了这些水凝胶的物理化学属性,包括成胶时间、胶含量及降解性,同时使用生死染色实验和噻唑蓝比色法实验评价了它们的细胞生物相容性.研究结果表明,葡聚糖的分子量越大、根皮酸的取代度越高、Dex-SS-PA的浓度越大,获得的水凝胶成胶时间越短、胶含量越高.在还原环境中,Dex-SS-PA水凝胶能够被降解.此外,这些水凝胶没有明显的细胞毒性.因此,这类新的水凝胶预示着较好的生物医学应用前景.

木瓜蛋白酶交联聚体的制备及性质

采用交联酶聚体(CLEAs)技术制得了木瓜蛋白酶CLEAs,优化了制备条件.以纯乙醇为蛋白沉淀剂,质量分数40%戊二醛为交联剂,于4℃下对酶沉淀聚体交联16h;所得木瓜蛋白酶CLEAs的最适pH为6.0(游离酶最适pH=7.0),最适温度范围由游离酶的80℃拓宽为50～80℃,热稳定性和溶液稳定性亦明显提高;微观形貌分析证明木瓜蛋白酶CLEAs优良的催化效能及稳定性来自于CLEAs单元所具有的高比表面积及单元内部多点共价固定的结合方式.

胰蛋白酶交联聚体的制备及性质研究

交联酶聚体(CLEA)是一种新型的无载体固定化技术.以胰蛋白酶为模型体系,系统地研究了CLEA技术的制备工艺、应用条件、稳定性及结构形貌.(1)在制备工艺中考察了各步骤对CLEA酶活保留的影响,重点分析了沉淀剂浓度、类型的影响,结果表明100%乙醇是较为理想的沉淀剂;(2)在应用条件确定中测定CLEA的最适催化温度为70℃,最适催化pH为9.0,并解释了温度-活性、pH-活性曲线的漂移现象;(3)稳定性研究结果表明CLEA技术大幅提高了胰蛋白酶的热稳定性、溶剂稳定性,且无酶泄漏;(4)在形貌表征中分别利用扫描电子显微镜、光学显微镜和激光粒度分析对CLEA的微观结构进行了多尺度研究,着重讨论了其独特结构与优良特性间的关系.本文所得结论为胰蛋白酶CLEA的应用提供基础数据,并为CLEA技术应用于其它酶种提供参考。

具有菲环骨架的高分子载体固定淀粉酶交联聚集体

用80%异丙醇溶液将淀粉酶沉淀聚集,随后用戊二醛交联制备交联淀粉酶聚集体(cross-linked amylase aggregates,CLEAs-A),最后将CLEAs-A共价固定在具有大孔的菲环骨架的载体上,制备固定化CLEAs-A。探讨各种优化条件,研究固定化CLEAs-A的酶学性质,结果显示固定化酶的热稳定性和储存稳定性明显提高,重复反应7批次后,相对活性仍保留63.29%。此外,扫描电子显微镜和孔径测量展现了固定化CLEAs-A的表面和孔径结构。此法可作为一种通用方法,制备出工业生产中所需要的具有高生物催化性能的固定化酶。

β-半乳糖苷酶交联酶聚体的制备及酶学性质研究

研究了乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶交联酶聚体(CLEAs)的制备条件和酶学性质,并应用于乳糖为底物催化制备低聚半乳糖(GOS)的反应体系中。结果表明:将β-半乳糖苷酶酶液稀释20倍,按体积比1∶1加入异丙醇,4℃下沉淀30min,加入体积分数为0.125%交联剂戊二醛,4℃下交联30min,离心洗涤,所得CLEAs的酶活保留达45.77%;与游离酶相比,β-半乳糖苷酶CLEAs的最适p H由7提高至8,最适温度由30℃提高至37℃,p H和温度的适用范围有所拓宽,且37℃下热稳定性提高1倍,具有更高的转糖苷活性选择性,适于制备功能性低聚半乳糖。

以大孔硅胶为载体的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备及性质研究

通过交联酶聚体与氨基化硅胶(活化硅胶)的共价交联,制备了以氨基化硅胶、无氨基化硅胶为载体的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体MSG(SG)-PAL-CLEAs、SG-PAL-CLEAs。优化了硅胶的氨基化条件以及MSG-PAL-CLEAs的制备条件,并且对游离酶,苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体(PAL-CLEAs),MSG-PAL-CLEAs和SG-PAL-CLEAs的稳定性进行了比较。优化的硅胶氨基化条件:3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)/硅胶2∶1(v/w),氨基化温度110℃,氨基化时间10h,在此条件下所得硅胶键合氨基数目是480μmol/g硅胶。优化的MSG-PAL-CLEAs制备条件:0.05g硅胶/mL酶液,吸附时间2.5h,吸附pH8.8,沉淀剂为硫酸铵,饱和度80%,交联剂戊二醛的浓度为1%,交联时间1h。SG-PALCLEAs的制备条件和MSG-PAL-CLEAs的制备条件大体相似,不同的是沉淀剂硫酸铵的饱和度为40%,交联剂戊二醛的终浓度为1.5%。研究结果表明,制备得到的MSG-PAL-CLEAs和SG-PAL-CLEAs的酶活回收率均为45%左右。与传统的PAL-CLEAs相比,MSG-PAL-CLEAs的重复使用性和储藏稳定性均有了显著提高,MSG-PAL-CLEAs转化4个批次后,酶活保留79%,而PAL-CLEAs转化2个批次酶活仅保留49%。25℃,PAL-CLEAs储存29d酶活保留26%,而MSG-PAL-CLEAs的酶活保留仍高达50%。

乳糖酶交联酶聚体的制备及性能

以双醛淀粉(DAS)为交联剂,分别制备了乳酸克鲁维酵母和米曲霉来源的乳糖酶交联酶聚体(CLEAs),同时添加牛血清白蛋白(BSA)作为保护剂以提高CLEAs活性。当DAS质量分数为10%、氧化度为80%、BSA与酶蛋白质量比为1∶8时得到的酵母和曲霉乳糖酶CLEAs的活力保留分别为53.84%和55.25%。CLEAs的最适pH值较游离酶有所降低。曲霉乳糖酶CLEAs在60℃下具有较好的热稳定性,并且在37℃下重复使用5次(20 h)后活力可保留52%。

转谷氨酰胺酶交联酶晶体的制备及其酶学性质研究

对转谷氨酰胺酶晶体进行了交联,研究了交联酶的基本酶学性质。结果表明,交联后,酶的耐高温性增强,在酸性、碱性条件下均比原酶更稳定,具有明显抵抗Fe3+、Zn2+及Cu2+的能力,而Ca2+、Mg2+及Ba2+对交联酶晶体没有明显的影响,在有机溶剂中的酶活力损失较小。与游离酶相比较,交联酶晶体在常温下贮存15d后的酶活力保留80%以上,远远地大于游离酶的剩余酶活。

乳糖酶交联酶聚体口服制剂的研究

乳糖酶具有良好的抗胰酶水解性能,适于作为口服制剂治疗乳糖不耐受症,但其抗胃酸能力较差,以海藻酸(ALG)为载体,并附尤特奇膜,制备乳糖酶交联酶聚体(CLEAs)口服制剂,其最佳制备条件为:以质量分数3%ALG与CLEAs混合液在质量分数3%CaCl2溶液中凝胶30 min得到凝胶微球,并覆3层质量分数3%尤特奇包衣,经胃肠液降解释放后活力保留可达43.29%,并且在肠液中1 h后释放出最大酶活。

基于可视化聚合酶交联螺旋反应快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)的新型可视化方法,本研究以S.aureus耐热核酸酶基因(nuc)为靶序列设计特异性引物,对其反应条件进行优化,建立聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)可视化检测方法,结果显示,PCLSR法在反应温度62℃,孵育时间60 min、dNTPs浓度为3.0 mmol/L、Bst-DNA聚合酶浓度为10 U/管时扩增效果最佳。提取14株金黄色葡萄球菌和9株非金黄色葡萄球菌基因组为模板,利用该方法进行特异性试验,结果显示,PCLSR法能有效检测到14株S.aureus,而对其他9株非S.aureus检测结果均为阴性,特异性良好。10倍倍比稀释S.aureus菌液(1×10^(7)cfu/m L~1×10^(0)cfu/m L)后提取基因组作为模板,进行敏感性试验,结果显示,PCLSR法与荧光定量PCR法具有相同的敏感性,检测下限均达到1×10^(2)cfu/m L,而环介导等温扩增(LAMP)敏感性为1×10^(3)cfu/m L,可见该PCLSR敏感性较高。利用该PCLSR、LAMP、细菌培养法和荧光定量PCR法同时检测46份人工污染的生猪肉、灭菌纯牛奶样品中金黄色葡萄球菌,以评价该方法的检测性能,结果显示,PCLSR与荧光定量PCR检测结果与样品符合率为100%,而细菌培养法和LAMP法与样品的符合率仅均为91.67%,可见该PCLSR可以用于临床样品的检测。本研究为动物疾病预防和食品卫生检验等领域快速检测S.aureus提供了新型检测方法。

腈水合酶交联酶聚集体在生成烟酰胺体系中的应用

采用交联酶聚集体(CLEAs)技术和球化酶技术对来自大肠杆菌的ES-NHT-118腈水合酶进行固定化.利用大分子葡聚糖醛作为交联剂交联腈水合酶,在优化了温度、p H、交联剂用量及交联时间后,腈水合酶CLEAs和球化酶的酶活回收率分别达到49.63%及52.88%.利用扫描电子显微镜对2种固定化酶进行了表征,将固定化酶用于催化3-腈基吡啶转化生成烟酰胺.同游离酶相比,腈水合酶CLEAs和球化酶显示了良好的p H稳定性和热稳定性,对高浓度底物的耐受性也有提升.酶活为4 U/m L,底物终浓度为50 mmol/L时,2种固定化酶在重复使用10次后分别保留了73.45%及61.26%的催化产率.

Candida rugosa脂肪酶交联酶晶体稳定性研究

交联酶晶体（ＣｒｏｓｓＬｉｎｋｅｄＥｎｚｙｍｅＣｒｙｓｔａｌ，ＣＬＥＣｓ）是一种新型的生物催化剂．本研究对Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ脂肪酶交联酶晶体的制备以及其稳定性进行了探索，制备得的交联酶晶体不仅保持酶原有的特性，而且提高了酶在极端环境条件（高酸碱度、高温）下的稳定性。

碱性蛋白酶交联酶晶体的制备及稳定性

研究了用透析平衡法制备碱性蛋白酶晶体的过程，在硫酸铵饱和度为２５％的条件下获得了符合要求的碱性蛋白酶晶体，然后采用戊二醛进行交联，制备出了交联酶晶体，并对其在高酸碱度、高温、有机溶剂或有机溶液中的稳定性进行了研究．实验结果表明，交联酶晶体有较高的稳定性．

β-葡萄糖苷酶交联聚合物的制备及酶学性质

对来源于黑布林的β-葡萄糖苷酶进行了交联法制备(CLEAs),并对其酶学性质进行了初步研究。结果发现,当异丙醇为蛋白沉降剂时CLEAs的酶活回收率最高达58.9%;该聚合酶的最适温度为55℃,显示出良好的温度耐受性;CLEAs的Km、Vmax和Ki值分别为5.74 m M、203.4μmol/(min·mg蛋白)和394.03 m M;此外,金属离子Hg2+、Ag+可显著降低CLEAs的酶活。

牛血清白蛋白对牛胰脂肪酶交联酶聚体制备及催化性能的影响

研究了牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)对牛胰脂肪酶交联酶聚体(Lipase-CLEAs)制备及其催化性能的影响。获得的优化制备条件为:BSA的添加质量浓度为0.05 g/L,用1%戊二醛交联2 h。在此条件下制备的固定化酶最大酶活回收率为70%,比不添加BSA制备的Lipase-CLEAs提高了15%。与游离酶相比,固定化酶的最适反应温度被提高了10℃,同时,添加BSA制备的Lipase-CLEAs的温度稳定性、p H和储存稳定性比游离酶和Lipase-CLEAs都有较大提高。在重复使用8次后,添加BSA制备的Lipase-CLEAs仍能保持初始酶活的80%,但未添加BSA制备的CLEAs只保留了30%的初始酶活。