一种基于儿茶素的多酚氧化酶交联聚集体制备及其高效催化合成茶黄素-3,3’-双没食子酸酯研究

为了更加高效低成本地制备茶黄素,以儿茶素作为多酚氧化酶蛋白的交联试剂,对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的多酚氧化酶进行了酶交联聚集体的制备并应用于茶黄素-3,3’-双没食子酸酯的合成。通过对酶交联参数优化以及交联前后的酶催化性能研究,结果表明,在pH 4.0,EGCG为0.5 mg·mL^(-1),多酚氧化酶活性200 U·mL^(-1),交联时间50 min时,可以获得交联酶的最佳酶活回收率。与游离酶相比,交联酶表现出更优异的催化性能(热稳定性、有机溶剂耐受性、底物耐受性)。交联酶被用于合成茶黄素-3,3’-双没食子酸酯时,产物质量浓度可达800μg·mL^(-1),且交联酶能被重复循环使用至少3个批次,利用该方法制备茶黄素,可以显著降低酶的应用成本,具有潜在工业化应用价值。

脂肪酶交联聚集体的制备及其催化合成月桂酸淀粉酯的研究

采用交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)技术制备了脂肪酶CLEAs,优化了制备条件:以硫酸铵为沉淀剂,以14 mmol/L戊二醛为交联剂,交联时间1.5 h,所得脂肪酶CLEAs的相对酶活力达到41.89%;与游离酶相比,脂肪酶CLEAs的热稳定性显著增强,重复使用性显著提高,重复使用10次后相对酶活力达到50.26%。以该脂肪酶CLEAs作为催化剂,以玉米淀粉和月桂酸为原料,进行了酯化反应,得到月桂酸淀粉酯的最大取代度为0.151。此外,利用红外光谱(Fourier transform infrared spectoscopy,FT-IR)对月桂酸淀粉酯进行了分子表征,发现在1 713 cm-1处出现了羰基CO的特征吸收峰,说明月桂酸与淀粉在脂肪酶CLEAs的催化作用下合成了月桂酸淀粉酯。同时,热重分析(TGA)表明,相比于原淀粉,酯化产物的热稳定有较低趋势。

具有菲环骨架的高分子载体固定淀粉酶交联聚集体

用80%异丙醇溶液将淀粉酶沉淀聚集,随后用戊二醛交联制备交联淀粉酶聚集体(cross-linked amylase aggregates,CLEAs-A),最后将CLEAs-A共价固定在具有大孔的菲环骨架的载体上,制备固定化CLEAs-A。探讨各种优化条件,研究固定化CLEAs-A的酶学性质,结果显示固定化酶的热稳定性和储存稳定性明显提高,重复反应7批次后,相对活性仍保留63.29%。此外,扫描电子显微镜和孔径测量展现了固定化CLEAs-A的表面和孔径结构。此法可作为一种通用方法,制备出工业生产中所需要的具有高生物催化性能的固定化酶。

碱性蛋白酶交联聚集体的制备及其催化性能研究

碱性蛋白酶在食品、医药、酿造、丝绸、皮革等行业中发挥着重要作用。制备了碱性蛋白酶交联体,并对其催化性能进行研究。在最佳制备条件下(90%叔丁醇作为沉淀剂,沉淀时间为15min,交联剂浓度为33mmol/L,交联时间为6h),交联酶的酶活回收率为22.6%。与游离酶相比,交联酶的最适pH值向碱性方向变化,由7.5变为8.0,最适温度由60℃变成65℃。酶动力学研究表明,交联酶对酪蛋白的催化水解能力(4.3min-1)比游离酶(3.7min-1)更高。尽管交联酶最大反应速度Vmax(9.8mg/(mL·min))低于游离酶(13.3mg/(mL·min)),但交联酶对底物的亲和力Km(2.3mg/mL)比游离酶(3.6mg/mL)有所增加,而且其热稳定性和酸碱稳定性都得到一定程度的提高。另外,在磷酸盐缓冲液中重复使用5和8批次后,交联酶还能保持82.5%和56.5%的酶活性。

复合蛋白酶交联酶聚集体制备枸杞蛋白多肽

该研究利用交联酶聚体技术制备出复合蛋白酶交联酶聚体固定化酶,以酶活回收率为指标,通过单因素实验得到复合蛋白酶交联酶聚集体最佳制备条件:风味蛋白酶与木瓜蛋白酶比例为3∶1,沉淀剂硫酸铵浓度为60%,戊二醛浓度0.5%,交联时间为50分钟,交联pH为7.5。此时最大酶活回收率为80.32%。相比单一蛋白酶,复合蛋白酶交联酶聚集体具有更好的热稳定性和pH稳定性,同时表现出良好的连续多次水解枸杞蛋白的性能。以蛋白水解度为指标,优化后复合蛋白酶交联酶聚集体最佳水解条件为:温度为60℃,pH为6,酶浓度为10 mg/mL,水解时间为100 min,在此条件下枸杞蛋白水解度为41.21%,比游离复合蛋白酶提高了6.9%。

磁性磷脂酶D交联酶聚集体的制备及其酶学性质

以磁性Fe3O4为载体,采用吸附-聚集-交联的方法固定来源于Streptomyces chromofuscus的磷脂酶D(scPLD),制备了磁性磷脂酶D交联酶聚集体(MCLEA)。该方法制备的MCLEA酶活回收率可达72.89%,酶活为(437.00±6.60)U/g。与游离酶相比,MCLEA在不同温度和pH下的稳定性都得到了一定程度的提升,但由于与底物的亲和力降低,需要更高浓度的磷脂酰胆碱(PC)和Ca^(2+)作为反应底物与MCLEA结合。乙醇、四氢呋喃、叔丁醇、乙酸乙酯、乙醚和甲苯对MCLEA的酶促反应具有促进作用,MCLEA在进行连续13次酶促反应后,酶活仍可保留在76%以上,其半衰期为331.67min,该固定化方案可以提高酶的稳定性,从而提高其在催化反应过程中的重复利用性。

交联酶聚集体与仿生硅化技术结合制备固定化脂肪酶

将交联酶聚集体(CLEAs)与仿生硅化技术相结合,制备了交联脂肪酶Candidasp.99-125杂化生物催化剂.以京尼平为交联剂,在最佳条件下制得的脂肪酶CLEAs的酶活达771U/g,回收率达75%;保护剂聚乙烯亚胺(PEI)与Candidasp.99-125脂肪酶共沉淀制备P/CLEAs,其酶活达897U/g,回收率约88%;利用PEI的诱导作用,在P/CLEAs表面形成氧化硅涂层,制得的脂肪酶CLEAs(Coated-CLEAs)显示出良好的稳定性,特别是其抗蛋白酶水解能力、有机溶剂耐受能力、重复使用性能等方面明显提高.

交联酶聚集体——一种无载体酶固定化方法

对一种崭新的无载体酶固定化技术———交联酶聚集体(Cross-linked Enzyme Aggregates,CLEAs)技术进行了文献综述。CLEAs技术是一种将蛋白质先沉淀后交联形成不溶性的、稳定的固定化酶。研究结果显示其活性和稳定性可与交联酶晶体(Cross-linked Enzyme Crystals,CLECs)技术相媲美。由于其制备不需要复杂耗时的结晶、纯化步骤,一般实验室都能实行,因而更有利于研究和应用的普及。该文就CLEAs的制备、在水溶液中的活性和稳定性在有机溶剂中的活性和作用机理及研究进行了介绍讨论。

磁性交联核酸酶P1聚集体的制备及性质研究

采用磁性纳米颗粒与酶蛋白共沉淀后经戊二醛交联的方法,制备了磁性交联核酸酶P1聚集体,并且对比分析了游离酶和固定化酶的部分酶学性质.优化的最佳制备条件为:硫酸铵质量浓度为0.8 g/mL,沉淀时间为0.5 h,戊二醛体积分数为0.6%,交联时间为2 h,所制得的固定化酶活性回收率为32.4%.酶学性质研究表明,固定化酶的Km值(30.7 mmol/L)明显高于游离酶的(7.27 mmol/L),二者最适反应温度分别为90℃和75℃,最适pH值均为5.2,固定化核酸酶P1对热和酸碱的耐受性明显增强,连续反应6次后酶活力仍保留70%,良好的操作稳定性和磁响应性有利于核酸酶P1的工业化应用.

交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备及其性质

交联酶聚集体法是一种新型的无载体酶固定化方法。本实验用该法固定化黑曲霉β-葡萄糖苷酶,对其制备条件、结构特征、酶学性质进行了研究。结果表明,β-葡萄糖苷酶酶液在冰水浴中经90%的硫酸铵沉淀30min后,以5%戊二醛水溶液进行酶聚集体交联反应,可获得较高活性的交联酶聚集体,酶活回收率达75%,对对-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷作用的最适温度、最适pH值和Km值分别为60℃、pH4.0和4.61×10-3mol/L,与游离酶相比,表现更高的底物亲和力。将其用于大豆异黄酮活性苷元染料木素的合成,40min内对染料木苷转化率达到66%。

交联酶聚集体法制备单宁酶及固定化酶性质研究

交联酶聚集体法(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)是一种新型的无载体酶固定化方法。使用该法固定化黑曲霉产单宁酶,制备无载体固定化单宁酶(Cross-linkedenzyme aggregates-tannase,CLEAs-TA),并对其制备条件、结构特征、酶学性质进行分析。结果表明,最优制备条件为单宁酶游离粗酶液在冰水浴中经80%的硫酸铵沉淀30min后,以1.5%戊二醛水溶液进行酶聚集体交联反应,可获得较高活性、较高稳定性的交联酶聚集体,酶活回收率达47.33%,对酯键水解作用的最适温度、最适pH值分别为50℃、4.5,与游离酶相比,表现更高的pH及温度稳定性,重复使用6次后,活力剩余32.86%,其良好的操作稳定性有利于没食子酸丙酯高效转化为没食子酸及广泛应用于水解茶饮料中单宁的反应。

包埋-交联磷脂酶A_1聚集体的制备及酶学性质

为得到可重复使用且活力较高的固定化磷脂酶A1,采用包埋-交联酶聚集体的方法对磷脂酶A1进行固定,对固定化条件和部分酶学特性进行优化和研究,确定最佳条件为:酶液质量浓度0.06g/mL、沉淀剂饱和度80%、沉淀pH6、沉淀时间35min、戊二醛体积分数0.4%、交联时间6.5h、海藻酸钠质量分数2%、Ca2+浓度0.25mol/L。得到包埋-交联磷脂酶聚集体A1的酶活回收率为80.2%。固定化酶热稳定性增强,重复使用7次相对酶活力保留在6 5%以上。

乳化法制备交联海藻糖合酶聚集体的研究

交联酶聚集体（CLEAs）是一种高活性的无载体固定化酶，常用的基于溶液法（Sheldon法）制备的CLEAs呈无定形的集簇体，影响其连续使用效率．以海藻糖合酶为模型酶，首次在油包水乳化体系中构建了CLEAs，利用扫描电镜和光学显微镜分析了所得CLEA的微观结构，考察了CLEAs的活性和重复使用性能．结果表明，乳化法制备的CLEAs外观呈较规则的微球形，粒径约20～60μm，其活性和重复使用性能均高于参照Sheldon法制备的CLEAs．

交联海藻糖合酶聚集体的制备及其性质

采用交联酶聚集体(CLEAs)技术制备交联海藻糖合酶聚集体,研究不同沉淀剂、酶与交联剂浓度比例、交联强度及硼氢化钠还原处理对海藻糖合酶CLEAs活性的影响及其结构特征与反应性能。结果表明:采用质量浓度为10mg/mL的酶以质量浓度为30mg/mL的聚乙二醇(PEG)为沉淀剂,以体积分数为0.5%的戊二醛室温交联2h,再以硼氢化钠还原处理后,制备得到的海藻糖合酶CLEAs最适催化温度为70℃,比游离酶提高20℃,最适pH值为7.0,与游离酶相比,CLEAs的温度及pH值稳定性均得到提高,对Zn2+、Cu2+、Fe2+、Al3+金属离子的抗性明显增强。微观形貌分析表明单个海藻糖合酶聚集体粒径在0.2～0.5μm,众多聚集体以"脚手架"结构形成大小不一的集簇。

交联木聚糖酶聚集体的制备及其性质研究

制备了交联木聚糖酶聚集体(CLEAs),并对其酶学性质进行了研究,以提高木聚糖酶的稳定性。通过毛栓菌发酵分离得木聚糖酶,经硫酸铵沉淀后以戊二醛作为交联剂对其进行化学交联,制得CLEAs,并用常规方法测定了各种因素对游离木聚糖酶和CLEAs的影响。在对耐热性、有机相中稳定性和耐酸碱性的研究中,CLEAs均表现比游离酶有较高的稳定性,因此运用CLEA技术可提高木聚糖酶的稳定性,使其广泛应用于饲料等工业生产中。

交联果胶酶聚集体的制备及其对罗布麻的脱胶效果

运用交联酶聚集体技术对枯草芽孢杆菌FM208849所产的果胶酶进行固定化,将制得的交联果胶酶聚集体用于罗布麻皮脱胶。结果表明,以体积分数为4%的戊二醛溶液在30℃水浴中对果胶酶聚集体交联135min,可以得到性能优异的交联果胶酶聚集体;利用5mL的10mg/mL果胶酶CLEAs悬浮液对沤麻液(含罗布麻皮1g)在45℃水浴中脱胶8h,可以使其残胶率降至4.61%;利用交联果胶酶聚集体对沤麻液进行10次脱胶实验后,其残胶率仍可保持在11.25%以下,可重复利用性较高。

模板法制备多孔交联脂肪酶聚集体碳酸钙及其特性

针对传统交联脂肪酶聚集体(cross-linked lipase aggregates,CLEAs)表面密实、比表面积小、无太多孔隙结构、在催化过程中存在扩散限制、影响酶催化效率等问题,该文通过脂肪酶、氯化钙、碳酸钠、硫酸铵共沉淀制备脂肪酶/碳酸钙微球,再加入二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)进行脂肪酶交联自组装,然后用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)去除碳酸钙模板剂,制得多孔交联脂肪酶聚集体微球(p-CLEAs),对其制备条件、结构特征、酶学性质进行研究。结果表明,最佳制备条件为:Ca^2+浓度0.35 mol/L、脂肪酶与Ca^2+比例5:1、沉淀剂饱和度80%、沉淀pH值为8、沉淀时间45 min、DTT体积分数0.2%、交联时间40 min。与常规CLEAs相比,所制备的p-CLEAs在甲醇耐受性、热稳定性和pH值稳定性方面均有明显改善,4℃保藏6个月,仍保持较高的活性。其结构稳定,形貌、孔道尺寸可调控,呈多孔结构,这种多孔结构使得底物分子更容易进入脂肪酶的活性位点,不仅降低了传质限制,还提高了催化效率,具有较高的催化活性。

交联糖化酶聚集体的制备

为了克服游离糖化酶的部分缺点,将游离糖化酶用合适的沉淀剂沉淀后,再用戊二醛作为交联剂进行交联,制备了新型的固定化糖化酶-交联糖化酶聚集体。研究结果表明,糖化酶最适聚集条件为:pH5.6,20℃,5g/L的糖化酶液中加入叔丁醇沉淀,可获得比较理想的糖化酶聚集体;最适交联条件为:向糖化酶聚集体中加入10%戊二醛水溶液交联120min,再经离心、洗涤数次后即得交联糖化酶聚集体,酶活力为游离糖化酶的40.4%。

腈水合酶交联酶聚集体在生成烟酰胺体系中的应用

采用交联酶聚集体(CLEAs)技术和球化酶技术对来自大肠杆菌的ES-NHT-118腈水合酶进行固定化.利用大分子葡聚糖醛作为交联剂交联腈水合酶,在优化了温度、p H、交联剂用量及交联时间后,腈水合酶CLEAs和球化酶的酶活回收率分别达到49.63%及52.88%.利用扫描电子显微镜对2种固定化酶进行了表征,将固定化酶用于催化3-腈基吡啶转化生成烟酰胺.同游离酶相比,腈水合酶CLEAs和球化酶显示了良好的p H稳定性和热稳定性,对高浓度底物的耐受性也有提升.酶活为4 U/m L,底物终浓度为50 mmol/L时,2种固定化酶在重复使用10次后分别保留了73.45%及61.26%的催化产率.

磷脂酶D交联聚集体的制备及其酶学性能研究

磷脂酶D(phospholipase D,PLD)可以催化磷脂的磷酸二酯键水解和转磷脂酰基反应,目前已广泛应用于化工和医药等行业。该研究利用交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates, CLEAs)技术开发了一种新型的PLD交联聚集体固定化酶(PLD-CLEAs)。以酶活性回收率为指标,确定了PLD-CLEAs的最佳制备条件:饱和度60%的硫酸铵为沉淀剂,质量分数0.125%的戊二醛为交联剂,交联反应时间为1.5 h,此时PLD-CLEAs的酶活力回收率为118.8%。与游离酶相比,PLD-CLEAs最适pH值向中性偏移,由8.0变为7.0;且PLD-CLEAs在较宽的温度和pH范围内均保持较高的酶活性,在高温(50℃)下的热稳定性明显提高。另外,在重复使用10次后,PLD-CLEAs仍能保持50.4%的酶活性。研究结果表明,PLD-CLEAs具有比游离酶更优异的热稳定性、pH耐受性和重复使用稳定性,有良好的工业应用前景。