酶促反应影响因素实验中存在的问题与改进探讨

酶促反应的影响因素实验是大学生物化学课程中的一个重要实验内容,通过实验,能让学生理解各因素对酶促反应的影响机制,使其运用理论知识分析并解决实验过程中存在的问题,提高学生的综合能力。然而,近几年的实验教学中普遍存在问题,直接影响了实验结果,导致成功率低甚至实验失败,以致挫伤学生做实验的积极性,不利于学生在实验中运用和掌握相关知识。文章就实验中存在的问题和改进办法展开分析,以期提高教学效率与质量。

大球盖菇干制过程香气变化规律及与关键酶促反应的关联性

采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术对不同干制时间段的大球盖菇子实体中挥发性风味化合物进行分离、鉴定,探究其在55℃恒温热风干制过程中挥发性风味物质的变化规律。在整个干制过程中共鉴定出245种挥发性风味化合物,其中包括34种醛类化合物、29种酯类化合物、40种醇类化合物、37种酮类化合物、7种酸类化合物、24种烷烃类化合物、26种烯烃类化合物及48种其他类化合物;醛、酮、醇类化合物占比较大,三者含量之和占总含量的65.49%~89.30%,为大球盖菇中主要的挥发性物质。通过气味活度值热图分析结合偏最小二乘判别分析法,筛选出45种关键气味化合物,其中1-辛烯-3-酮始终是干制过程中气味贡献最大的化合物,整个干制过程中共有20种差异性化合物。综合分析得到大球盖菇干制过程香气变化规律:随着干制的进行,样品土腥味、青草气味逐渐减弱,干制后期呈现焦香、麦芽香等风味,但整个过程中蘑菇味、土腥味仍是大球盖菇的关键风味特征。对合成醛、酮、醇类化合物的主要代谢途径中的关键酶酶活进行测定,发现此类酶会受热激活,随干制的进行酶活整体呈现显著下降趋势,在干制终点几乎没有活性。代谢酶活性与对应化合物含量相关性分析表明,脂肪氧合酶与醛酮类化合物具有较强的正相关性,乙醇脱氢酶与醇类化合物具有较强的负相关性,这与大球盖菇干制过程中醛、酮、醇类化合物含量的动态变化趋势一致。

酶促反应结晶研究进展

在“双碳”背景下,绿色可持续的酶促反应正受到工业界的广泛关注,但在实际应用中仍面临着诸多挑战,如反应平衡的限制、不稳定产物的分解、酶的产物抑制等。结晶作为一种高效成熟的分离技术,可通过移除液相产物的方式有效解决上述问题。同时,结晶也是晶体产品的“生成”过程,其与酶促反应耦合可一步实现晶体产品的高效、绿色、可控制备。综述了近年来酶促反应结晶的研究进展,介绍了原位产物结晶(ISPC)技术的发展历程,并讨论了结晶与酶促反应耦合时的相互影响关系;从结晶方式和过程控制角度阐述了酶促反应结晶的实现形式和连续化过程;最后,对酶促反应结晶这一耦合过程的发展和应用进行了总结和展望。

酶促反应结合灰度分析技术快速测定烟草及其制品中葡萄糖的含量

烟草样品溶液中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的作用下,可使色原性氧受体4-氨基安替比林与酚定量缩合,生成红色醌类化合物,通过Image软件将溶液颜色转化为灰度值信号,从而确定样品中葡萄糖的含量。样品经干燥、研磨后,分取(0.1±0.000 1)g,加入20 mL水,于(30±0.5)℃振荡萃取30 min。用快速定性滤纸过滤,弃去初始滤液,收集后续的2~3 mL滤液备用。移取100μL上述滤液于装有R1和R2试剂各450μL的2 mL微量离心管中,混匀后置于(37±0.5)℃的恒温水浴摇床中反应5 min。利用智能手机对显色液拍照,通过Image软件将彩色图片转化为灰度模式,得到灰度值。以水为参比,对显色液灰度值进行归一化处理,得到灰度值比值。以葡萄糖浓度的对数为横坐标,灰度值比值为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:标准曲线的线性范围为0.100~4.000 mmol·L^(-1),检出限(3s)为0.021 6 mmol·L^(-1);对相同浓度的葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖等9种糖类化合物标准溶液进行测定,除葡萄糖外,其余糖类显色液的灰度值与空白溶液无明显差别;对标准烤烟样品进行精密度和回收试验,测定值的相对标准偏差(n=6)均不大于4.0%,葡萄糖的加标回收率为98.3%~103%;方法用于实际样品分析,并与高效液相色谱法进行比对,结果表明在95%置信度下,两种方法测定结果无显著性差异。

随机负反馈酶促反应模型的动力学行为

文章研究了一个受白噪声扰动的具有负反馈效应的随机酶促反应模型的动力学行为.首先,给出研究需要用到的预备知识.然后,文章主要证明了随机负反馈酶促反应系统的正解是唯一的并且会全局存在.最后,通过构造一个适当的李雅普诺夫函数,证明了随机酶促反应系统具有平稳分布,并且得到对应的随机模型总是具有遍历性,且不需要任何的附加条件.

功率超声对酶促反应的影响

本文评述了功率超声在水溶液和有机溶剂中对酶促反应的影响，对固定化酶的影响。同时探讨了功率超声影响酶促反应的可能机理，并评价功率超声作为一种工业生物化学反应促进手段的可能性。

一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其酶促反应适宜条件初步研究

为了分离、筛选产纤维素酶益生菌,确定其酶促反应适宜条件,利用羧甲基纤维素钠等作为筛选培养基,结合刚果红染色法,从玉米青贮饲料样品中筛选产纤维素酶益生菌,并通过形态学和系统进化树方法鉴定分离菌。同时对培养时间、pH和温度等酶促反应条件进行了研究。结果表明,筛选出1株可降解羧甲基纤维素,并产生清晰透明圈的菌株。经形态学观察和16SrRNA基因序列分析,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。粗酶液中滤纸酶活为1.5U/mL,外切葡聚糖酶活为1.3U/mL,内切葡聚糖酶活为6.4U/mL,β-葡萄糖苷酶活为2.3U/mL。酶促反应的适宜条件为pH 5.5,温度50℃,粗酶液为培养3d后发酵液上清。解淀粉芽孢杆菌分离株具有一定的产纤维素酶能力,在玉米秸秆生物降解与利用方面具有潜在的开发价值。

在非水介质中进行酶促反应的几个重要问题

介绍了在非水介质中酶促反应的最新进展。较深入地讨论了介质性质对酶的催化活性及立体选择性的影响,有机溶剂中必需水含量对酶催化反应的重要性,描述了非缓冲体系中的盐及其它极性添加剂对酶活性的影响,介绍了在非均相的低共熔体系中进行酶促合成肽的研究。

低温光照下与黄瓜子叶叶绿素降低有关的酶促反应

黄瓜子叶在低温光照下处理时,随着时间的延长,Chl含量和CAT活性显著下降,POD和AsA-POD在开始24h活性亦有下降趋势,随后POD活性显著增加,而AsA-POD活性仅稍有提高。Chl含量的减少和CAT活性降低之间呈正相关,与POD活性的增加呈负相关。低温、光照处理的黄瓜子叶内Chl的降低可被亚胺环己酮(CHM)延缓,被AsA、Vit E、没食子酸丙酯(PG)和DCMU抑制,但被H_2O_2,乙醇酸钠和甲基紫精(MV)加速。

超声对有机溶剂中酶促反应的影响

作为一种环境友好的技术手段,近年来超声波在有机化学研究中的应用发展十分迅速。由于超声的机械效应能够提高非均相反应体系的反应速度,因此超声在非水酶学的研究中也是一种有效的技术手段。文章较为详细地介绍了超声在非水酶学中的应用,同时评述了超声辐射作用下酶在有机溶剂中催化反应的影响因素,也探讨了超声辐射影响酶促反应的可能作用机理。

菲降解菌的降解特性及酶促反应动力学研究

通过对取自MBR膜生物反应器中的活性污泥加入菲进行富集培养、驯化,分离、纯化出一株能以菲为唯一碳源和能源的短杆状革兰氏阴性菌J-1,细菌长2～5μm,宽1～3μm;研究了初始底物浓度、温度、pH对菌株J-1降解菲的影响,探讨了菌株J-1胞内酶对菲降解的底物抑制动力学。试验表明:菌株J-1在48h内能将不同浓度菲的水溶液中的菲完全降解;菲浓度增加,达到完全降解的时间延长。温度对细菌的降解能力影响较大,菌株J-1对菲降解的最佳温度为28℃。1.15mg·L-1的菲,28℃时48h内能完全降解,而相同时间内10℃时的降解率仅为36.65%。菌株J-1对pH的波动具有一定的适应性,pH在一定范围内(6.0～8.4)变化对菲降解的影响不大,降解反应的最佳pH为7.2。菌株J-1对菲的降解符合一级动力学反应方程。较高的底物浓度对酶促降解反应具有抑制作用,酶促反应的最大速率常数vm=1.17mg·L-1·h-1,米氏常数Km=61.70mg·L-1;底物抑制常数kS=49.60mg·L-1;最佳底物浓度[S]opt=55.32mg·L-1。

不同酶促反应条件及热处理对木聚糖酶活的影响

本试验研究了还原糖法不同酶促反应时间、温度和pH值及干热、湿热处理等因素对木聚糖酶活的影响。结果表明 :大多数酶制剂产品获得最高木聚糖酶活的酶促反应条件是 10min、6 0℃和pH6 35。酶活测定时各酶制剂具有较宽的温度适应范围 (35～ 75℃ )和较宽的pH值适应范围(pH4 5～ 7 4 )。各酶制剂在较高温度 (6 5～ 95℃ )下干热处理 10min ,其酶活损失较少 ,而在 85℃湿热处理时间愈长 ,其酶活损失愈多。

甲基对硫磷水解酶酶促反应体系建立及特性研究

从甲基对硫磷降解菌DLL E4 (Pseudomonasputida)中提取水解酶 ,对其酶促反应进行研究 ,建立了反应体系 :4 74 μLNa2 HPO4 柠檬酸缓冲液 ,12 5 μL甲基对硫磷 ,1 5 μg粗蛋白 ,35℃水浴 5min。水解酶保持稳定的 pH值范围为 5 0～ 10 0 ,最适 pH为 7 0。该酶热不稳定 ,4 5℃ 30min处理 ,酶活下降 5 0 % ;10 0℃ 10min处理可完全灭活。测定了 11种金属离子、TWEEN 80、TritonX 10 0及EDTA对水解酶的作用 ,发现 2 0mmol·L-1CoCl2 对酶活有明显的抑制作用 ,而 2 0～ 0 0 2mmol·L-1的LiCl对酶活有促进作用 ,2mmol·L-1的TWEEN 80和TritonX 10 0可降低 80 %的酶活。

γ-环状糊精葡萄糖基转移酶产生菌32-3-10产酶条件及酶促反应条件的研究

筛选到一株芽胞杆菌 32 - 3- 10 ,它所产γ -环状糊精葡萄糖基转移酶可以淀粉为底物生成γ -环状糊精 ,对其产酶条件及酶促反应条件进行了研究。

通过酶促反应制备壳寡糖

用酶降解法对壳聚糖进行降解 ,研究了温度、pH值、金属离子等对酶促反应的影响 ,降解的最佳温度和pH值分别为 5 0℃和 5 0 ,Mg2 + 和Ca2 + 对酶降解具有一定的促进作用 ,而重金属离子Cu2 + ,Ni2 + 和Zn2 + 对酶降解有强烈的抑制作用。通过降解过程中壳聚糖溶液粘度的变化可以得出 ,该壳聚糖酶是以内切方式作用于壳聚糖。采用离子交换色谱柱对降解产物进行分离 ,得到了聚合度为 2～ 9的壳寡聚糖。该酶促反应符合米氏动力学方程 ,米氏常数Km 值为 2 60 1g/L ,Vmax 值为 3 5 79× 10 - 2 g/min·L。

5,5′-二硫硝基苯甲酸柱前衍生高效液相色谱法测定酶促反应液中的L-半胱氨酸

以5,5′ 二硫硝基苯甲酸(DTNB)为柱前衍生试剂对酶促反应液进行衍生化,用C18色谱柱在室温下采用二元梯度洗脱,于330nm波长下检测,同时以2 巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT)为对照,对L 半胱氨酸的分离峰进行确认,并对酶促反应液中的L 半胱氨酸进行分离测定。L 半胱氨酸浓度为5～950μmol/L时,其浓度与峰面积呈显著的线性关系。高、中、低浓度水平的L 半胱氨酸加标回收率为99 7%～100 5%,相对标准偏差小于1 3%,检测限为0 8μmol/L。方法简便、快速、可靠。用于样品分析,结果令人满意。

根皮苷氧化物POP2的酶促反应体系及其结构表征

【目的】根皮苷氧化物POP2是苹果汁加工过程中由酶促氧化生成的一种多酚氧化物,对果汁的褐变和劣变有着重要影响。通过多酚氧化酶氧化根皮苷反应体系的建立,POP2的分离纯化与结构表征,探讨根皮苷氧化物POP2合成条件与反应历程,为苹果汁中POP2的检测分析,及弄清其对果汁褐变和劣变的影响奠定基础。【方法】通过p H、温度、底物浓度3个单因素试验建立根皮苷酶促氧化体系的基础上,研究乙醇溶液对酶促反应的促进作用和反应历程,通过高效液相色谱法检测根皮苷酶促氧化过程中根皮苷、中间产物及POP2含量的变化,通过乙酸乙酯萃取、无水乙醇除盐、重结晶等方法对氧化产物POP2进行分离纯化,并采用质谱(ESI-MS)和红外光谱(IR)对POP2进行结构表征。【结果】根皮苷酶促氧化反应的最佳条件为p H 6.5、35℃、底物浓度3 mg·m L^(-1),添加不同浓度的无水乙醇均能显著提高根皮苷酶促氧化速率,当添加浓度为20%时,可提高反应转化率,最大为2.4倍;根皮苷反应液随时间的变化颜色也发生改变,反应刚开始溶液颜色呈微黄色,随着反应的进行颜色逐渐从亮黄色变为橙黄色,最终产物的颜色为橙红色;高效液相色谱法分析根皮苷酶促氧化反应历程发现,当底物浓度为3 mg·m L^(-1),反应48 h时,根皮苷的转化率最大为90.2%,中间产物X1和POP1也基本接近痕量,POP2的积累量基本不再发生变化;通过乙酸乙酯萃取可以将反应液中残留的根皮苷除去,用无水乙醇除盐并经甲醇重结晶后,获得纯度为96.8%的POP2;经正离子模式ESI-MS分析,POP2的m/z为467,分子式为C_(21)H_(22)O_(12);IR结果发现POP2具有特征性的醚、氧化羧基、酮基及苯环官能团,与推测的根皮苷氧化物结构式吻合。【结论】根皮苷酶促氧化体系中的主要氧化物为POP2,可以根据POP2的含量高低建立苹果汁褐变和劣变的标志性检测指标。

微量热法研究单底物酶促反应的产物抑制作用

本文建立了有产物抑制的单底物酶促反应动力学的对比进度方程和热动力学的数学模型.根据此模型,可由反应的热谱曲线方便地解析出动力学参数(K_m,K_i和V_m)和摩尔反应焓(△_rH_m),并同时确定产物的抑制类型.用微量热法研究了精氨酸酶催化水解L-精氨酸的热动力学,确定水解产物L-鸟氨酸属于竞争性可逆抑制剂,298.15K和pH 9.4时L-鸟氨酸与精氨酸酶作用的抑制常数K_i=1.22×10^(-3)mol·L^(-1).实验结果验证了本文有产物抑制的单底物酶促反应热动力学研究法的正确性.