大鼠肝微粒体中间尼索地平的HPLC法测定与酶促反应动力学

建立了HPLC法测定大鼠肝微粒体中的间尼索地平及相应的酶促反应动力学。采用C18色谱柱,乙腈-水(62∶38)为流动相,检测波长237nm,样品经氢氧化钠溶液碱化后用乙醚-正己烷(1∶1)萃取。间尼索地平在1.56～100μmol/L浓度范围内线性关系良好。本法的相对回收率为93.0%,RSD为3.75%;日内、日间RSD分别为6.04%和1.53%。

大鼠肝细胞液体外甲基化代谢丹酚酸A的酶促反应动力学

目的筛选大鼠肝细胞液作为儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)供体,建立丹酚酸A(SAA)体外孵育甲基化代谢的酶促反应。方法采用HPLC-UV法检测孵育体系中底物SAA的浓度,根据底物消耗量计算SAA的体外酶促代谢反应速度和动力学参数。结果在大鼠肝细胞液体外温孵体系中,SAA的酶促甲基化代谢反应呈现饱和动力学特征,符合Michaelis-Menten曲线,最大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km)分别为30.4 nmol·mol-1·min-1,0.179 mmol·L-1。结论大鼠肝脏的COMT酶对SAA有较强的亲和力,可催化SAA发生快速、完全的甲基化代谢,大鼠肝细胞液与SAA在控制条件下体外温孵是高收率、选择性制备SAA甲基化代谢产物的一种有效手段。

黄皮酰胺对映体在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学

目的 研究黄皮酰胺 (clausenamide ,Clau)对映体在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学并比较其立体选择性差异。方法 应用反相HPLC法测定Clau对映体在体外代谢系统中的产物 ,并用Eadie Hofstee作图法分析数据、求算酶促反应动力学参数Km 和Vmax以及肝代谢速率Vmax Km。结果 在体外代谢系统中 ,左旋黄皮酰胺主要生成 7 羟 Clau、5 羟 Clau和 4 羟 Clau ,其优势代谢途径为 7位羟化 ;7位羟化代谢的Vmax Km 值高于 5位和 4位。右旋黄皮酰胺的 4位羟化反应Km 最小、Vmax最大 ,因此代谢速率最高 ,是左旋体 4位羟化的 8倍 ;而其 7 羟 Clau和 5 羟 Clau的产生量很小。结论 黄皮酰胺对映体在大鼠肝微粒体中的羟化代谢存在明显的底物立体选择性差异。

瑞格列奈在人肝微粒体中的酶促反应动力学及葛根素对其代谢的影响

目的通过体外人肝微粒孵育实验考察瑞格列奈的酶促反应动力学,并研究葛根素对瑞格列奈代谢的影响。方法以阿托伐他汀为内标,建立UPLC法测定人肝微粒体中瑞格列奈的浓度。建立人肝微粒体体外孵育体系,确定最佳蛋白浓度和孵育时间;采用原形药物减少法,通过GraphPad Prism 5.0软件计算酶促反应动力学参数(V_(max)和K_(m));系列浓度葛根素(0~50μmol·L^(-1))与瑞格列奈(5.5μmol·L^(-1))在肝微粒体孵育体系中于37℃水浴共同孵育,测定肝微粒体中瑞格列奈的浓度,并计算减少量,从而考察葛根素对瑞格列奈代谢的影响。结果瑞格列奈在人肝微粒体的最佳蛋白质量浓度为0.5 mg·mL^(-1),最佳孵育时间为40 min;酶促反应动力学参数V_(max)=1.71μmol·min^(-1)·(mg·protein)^(-1),K_(m)=5.66μmol·L^(-1)。结论UPLC法测定人肝微粒体中瑞格列奈的浓度,灵敏度高、操作简便。通过人混合肝微粒体孵育实验得到瑞格列奈的酶促反应动力学参数,且进一步研究显示葛根素对瑞格列奈在人肝微粒体未产生显著的抑制作用,可为两药的联合应用提供参考。

恒定磁场对α-淀粉酶反应过程的影响及磁场中的酶促反应动力学

随着磁场生物效应的研究和应用的发展,人们发现了磁场对某些酶活性的影响~{1-3}。

大鼠肝微粒体中钩吻素子UPLC-MS/MS法测定与酶促反应动力学研究

目的建立UPLC-MS/MS法测定大鼠肝微粒体中钩吻素子的浓度及其酶促反应动力学研究。方法优化钩吻素子与肝微粒体的反应体系,采用UPLC BEH C18色谱柱,流动相为甲醇-水(两者均含0.1%甲酸),梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,进样量为1μL,质谱采用正离子,MRM模式检测孵育体系中钩吻素子的浓度,并应用Linewearve-Burk作图分析数据,计算酶促动力学常数。结果钩吻素子在0.5～30μM范围内线性良好,回归方程为y=0.1544x-0.0593(r=0.9939,n=5)。钩吻素子的酶促反应动力学参数Km为14.2μmol/L,Vmax为303.03pmol/(min.mg.pro)以及肝清除率CLint(Vmax/Km)为21.37μL/(min.mg.pro)。结论该方法简单、快速、可靠,适应于钩吻素子的体外代谢研究。

Hirulog-s纤溶酶促反应动力学的常数测定

Hirulog-s为军事医学科学院通过对水蛭素结构改造获得的一种新型合成水蛭肽,其序列为：（D）-FPRP-GK（Stearic acid）-GG-QGDFEPIPEDA-YDE-NH2,Hirulog-s半衰期达到T1/2=212.2±58.4min.水蛭素具有间接促进尿激酶诱导的纤溶作用,为考察新型水蛭肽Hirulog-s影响纤溶因子亲和性的程度,本文基于单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（pro-uPA）和纤溶酶原（plg）的相互活化作用研究Hirulog-s通过酶促反应动力学参数体现出来的纤溶特性.

生物化学说课稿——《酶促反应动力学》

结合实践,从说课程、说教法、说学法、说教学过程、教学评价分析和说板书设计六个方面来阐述对生物化学中"酶促反应动力学"的设计思路。

异育银鲫肝微粒体体外恩诺沙星N-脱乙基酶酶促反应动力学初步研究

建立了异育银鲫肝微粒体体外孵育恩诺沙星(enrofloxacin,EF)的酶促反应体系,应用RP-HPLC法检测其主要代谢产物环丙沙星(ciprofloxacin,CF),以间接反映恩诺沙星N-脱乙基酶的活性。采用二氯甲烷提取、正已烷去脂提取有效成分,样品回收率均大于81.4%,含CF或EF的肝微粒体样品能在4℃下稳定至少72 h,日内变异系数不超过3.51%,日间变异系数不超过3.71%,EF和CF准确度分别小于8.1%、6.5%,检测限(信超比为3)分别为0.15μmol/L、0.3μmol/L。恩诺沙星在银鲫肝微粒体中代谢符合一级消除方程C=140e-0.072t,消除速率常数(K)为0.072/h,消除半衰期(T1/2)为9.627 h。用Origin Lab软件的Hyperbl模型进行拟和,以方程y=P1.x/(P2+x)表示米氏常数Vmax、Km两者的关系,求得Vmax为0.2602±0.0147nmol/mg.min,Km为53.8985±10.2257μmol/L,内在清除率(Clint)约为0.0048 mL/(min.mg)。恩诺沙星消除率和环丙沙星转化率的研究结果提示,恩诺沙星在银鲫肝微粒体中的代谢以N-脱乙基反应为主,提示可能还通过其它途径生成另外代谢产物。而酶动力学研究数据(Vmax,Clint值)表明,恩诺沙星N-脱乙基酶与底物结合力不强,酶促反应强度处于中等水平。据此,笔者推测恩诺沙星在银鲫肝微粒体中的代谢速度较为缓慢。

基于酶促反应动力学的无标准品ELISA抗体滴度定量方法

目的建立无标准品的酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体滴度定量方法。方法对血清抗体ELISA检测设置非特异、阴性对照、特异和总抗体检测组。显色早期的时间-吸光度数据经线性拟合的斜率即吸光度变化速度,分别记为ν0、νC、νS、νT。基于底物过量时ν值与待测抗体浓度(C)呈直线关系,设计ν值函数计算待测样本与阴性对照样本的抗体浓度倍比。以鱼胶原蛋白免疫昆明小鼠的血清特异IgG抗体检测进行实例分析。结果函数C/CC=(ν-ν0)/(νC-ν0)可计算待测样本与阴性对照样本的特异抗体浓度倍比(滴度)。结论该动力学ELISA抗体滴度检测方法适用于无标准品半定量分析。

枯草杆菌碱性磷酸酶制备的最佳工艺条件及酶促反应动力学性质的研究

以枯草杆菌为菌种液体培养制备碱性磷酸酶 ,研究确定了培养的最佳工艺条件 ,并对碱性磷酸酶的酶促反应动力学性质进行了初步探讨。结果表明 ,枯草杆菌制备碱性磷酸酶的最佳工艺条件为 :4 0℃ ,pH值 7.4振荡培养 10h ,酶活最高。对碱性磷酸酶的动力学性质研究表明 ,该酶催化底物磷酸苯二钠水解反应的最适pH值 8.8,最适温度 5 2℃ ,米氏常数Km值为 2 .94mmol/L。

钩吻素子在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究

目的建立体外实验法研究钩吻素子在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学。方法以钩吻碱甲标准品为内标,采用液质连用(UPLC/MS)的方法测定钩吻素子在体外代谢30min后剩余钩吻素子的含量。UPLC采用BEH C18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm),流动相为0.1%甲醇酸-0.1%甲醇水(20∶80),流速为0.3mL·min-1,进样量为1μL,柱温为40℃,MS采用正离子、多反应监测(MRM)模式监测,离子监控通道m/z307.1>69.76(钩吻素子),m/z 323.1>69.76(钩吻碱甲),毛细管电压2.8kV,锥孔电压35V,离子源温度110℃,脱溶剂温度300℃,锥孔气(N2)流速50L·h-1,脱溶剂气(N2)流速450L·h-1。用Linewrave-Burk作图分析数据,计算酶促动力学参数。结果钩吻素子在0.5～30uM范围内线性良好Y=0.1544X+0.0593,r=0.9939结论此方法简单、快速、可靠,适用于钩吻素子的体外代谢研究。

奥美拉唑在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究

目的研究奥美拉唑在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学。方法采用高效液相色谱法测定奥美拉唑在体外代谢系统中的产物5’-羟基奥美拉唑,并用Eadie-Hofstee作图法分析数据,计算酶促反应动力学参数最大反应速率(Vmax)、米氏常数(Km)。结果在体外代谢系统中,奥美拉唑生成5’-羟基奥美拉唑的Vmax为2010nmol/(min.mgprotein)、Km为50.3μmol/L。结论本分析方法符合方法学验证的要求,体外代谢常数准确,可满足奥美拉唑体外代谢的研究。

黄芩素在溃疡性结肠炎模型大鼠肝、肠微粒体中酶促反应动力学研究

目的考察黄芩素在正常和溃疡性结肠炎大鼠肝、肠微粒体中的酶促反应动力学差异。方法采用3%葡聚糖硫酸钠连续自由饮用10 d,诱导溃疡性结肠炎大鼠模型,分别制备正常和溃疡性结肠炎大鼠肝、肠微粒体,通过建立大鼠肝、肠微粒体体外孵育体系对黄芩素代谢进行研究,采用HPLCDAD检测方法对代谢产物黄芩苷进行定量测定,应用Graph Pad Prism 5.0软件分析数据,对比黄芩素在正常和溃疡性结肠炎模型中的酶促反应动力学常数最大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km)。结果黄芩素(5~150μmol·L^(-1))在正常和溃疡性结肠炎大鼠肝微粒体中的代谢属于经典的米氏方程,Km分别为(59.13±7.756)、(57.45±6.699)μmol·L^(-1),Vmax分别为(6.086±0.3234)、(7.447±0.347)μmol/(min·mg),而在肠微粒体中符合底物抑制动力学特征,抑制速率(Ki)分别为(166.4±58.31)、(141.7±41.17)μmol·L^(-1),Vmax分别为(4.130±0.6035)、(5.797±0.7903)μmol/(min·mg)。不管是正常组还是模型组,黄芩素在肝脏中的代谢速率要显著高于肠微粒体;与正常组相比,溃疡性结肠炎大鼠肝、肠微粒体中黄芩素葡萄糖醛酸化反应的速率显著升高,同时发现了黄芩素的一个新代谢产物,可能为黄芩苷的同分异构体。结论溃疡性结肠炎疾病状态能够显著升高葡萄糖醛酸化转移酶的活性,可能是导致黄芩苷在疾病状态下体内暴露强度增加的因素之一。

雷公藤甲素在大鼠肝微粒体中代谢及酶促反应动力学研究

目的:研究雷公藤甲素在大鼠肝微粒体中代谢及酶促反应动力学。方法:将雷公藤甲素与5种不同诱导剂(地塞米松(DEX)、苯巴比妥(PB)、β-萘黄酮(β-NF)、吡啶(PD))诱导的大鼠肝微粒体进行体外共孵育;并与8种选择性CYP酶抑制剂(酮康唑、醋竹桃霉素、磺胺苯吡唑、二乙基二硫代氨基甲酸酯(盐)、奎尼丁、呋拉茶碱、毛果芸香碱、奥芬那君)在空白肝微粒体中共孵育。采用液相色谱-质谱联用技术测定孵育后剩余雷公藤甲素的含量。结果:酮康唑和醋竹桃霉素能明显抑制雷公藤甲素的代谢;磺胺苯吡唑和奥芬那君对其代谢也有一定抑制作用,但不及酮康唑和醋竹桃霉素。结论:雷公藤甲素在大鼠肝微粒体中代谢主要由CYP3A介导,其次由CYP2C和CYP2B介导。

延胡索与白芷组分配伍对延胡索乙素在大鼠肝微粒体中酶促反应动力学的影响

目的研究延胡索总生物碱(TA)中延胡索乙素(TET)在肝微粒体中的酶促反应动力学,并比较白芷有效组分白芷香豆素(Cou)、挥发油(VO)与TA配伍后对TET酶促反应动力学的影响。方法超速离心法制备大鼠肝微粒体,采用高效液相色谱法测定孵育液中TET原形药物的浓度。比较TA、TA-Cou、TA-VO、TA-Cou-VO配伍各组中TET的酶促反应动力学,推导出药物米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax);并计算TET肝内清除率(CLint)。结果 TA配伍组中的TET在大鼠肝微粒体内代谢反应的Vmax、Km和CLint分别为0.12μmol/(L.min.mg)、5.40μmol/L、0.022 L/(min.mg);TA-Cou组分别为0.27μmol/(L.min.mg)、40.18μmol/L、0.006 L/(min.mg);TA-VO组分别为0.57μmol/(L.min.mg)、22.60μmol/L、0.025 L/(min.mg);TA-Cou-VO组分别为0.84μmol/(L.min.mg)、23.25μmol/L、0.036 L/(min.mg)。结论 TA配伍白芷有效组分可降低TA中TET在肝内的CLint。

染料木苷在大鼠肝微粒体中的代谢及酶促反应动力学研究

目的建立HPLC-MS法,初步鉴定染料木苷在大鼠肝微粒体中的代谢产物,并研究其酶促反应动力学。方法建立大鼠肝微粒体体外孵育体系对染料木苷进行代谢研究,应用HPLC-MS鉴定其体外代谢产物。以磺胺甲唑为内标,采用代谢物生成法,对代谢产物染料木素进行定量测定。应用Graph Pad Prism 5.0软件分析数据,计算酶促反应动力学常数Vmax和Km。结果染料木苷在体外孵育体系中生成代谢产物,经鉴定其为苷元染料木素。染料木苷在大鼠肝微粒体中最佳温孵时间为40 min,最佳蛋白质量浓度为1 mg·m L-1,底物浓度为50μmol·L-1,代谢产物染料木素酶促反应的Vmax=(0.104 2±0.003 3)μmol·min-1·mg(pro)-1,Km=(28.96±2.80)μmol·L-1。结论染料木苷在大鼠肝微粒体中通过水解反应,生成相应苷元。代谢物生成法是一种可靠、简便测定肝微粒体酶促反应动力学参数的方法,所得到的酶促反应动力学参数为染料木苷进一步研究提供了重要参数。

蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究

目的研究蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学。方法以回芹内酯为内标,采用液质联用(LC/MS)的方法测定蛇床夫内酯在体外代谢中的代谢产物3″,8-甲氧基异欧前胡内酯(M1)和5″-羟基-8-甲氧基异欧前胡内酯(M2)。用Linewrave-Burk作图分析数据,计算酶促动力学常数。结果代谢物M1的Vmax=1.152 5μmol.(min.mg pro)-1,Km=133.156 6μmol.L-1,M2的Vmax=1.630 8μmol.(min.mg pro)-1,Km=292.857 1μmol.L-1。结论该方法简单、快速、可靠,适用于蛇床夫内酯的体外代谢研究。

辛芍组方效应成分在正常和脑缺血再灌注损伤大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学分析

目的:研究辛芍组方中效应成分灯盏乙素、灯盏甲素和芍药苷在正常大鼠和大脑中动脉闭塞(MCAO)局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学,比较上述成分在不同状态大鼠肝微粒体中的体外酶代谢动力学差异。方法:制备不同状态大鼠的肝微粒体,将辛芍组方与大鼠肝微粒体进行孵育,选择UPLC-MS为分析手段,采用底物消除法,计算各成分在正常大鼠和MCAO大鼠肝微粒体中的酶反应动力学米氏常数(Km),最大反应速率(Vmax)及体外肝微粒体对药物的固有清除率(CLint),将各参数进行组间统计学分析。结果:灯盏乙素、灯盏甲素和芍药苷在正常大鼠体外肝微粒体中的Km[(0.597±0.065),(0.166±0.012),(0.640±0.046)μmol·L^-1]与MCAO大鼠中的Km[(0.798±0.031),(0.213±0.017),(0.499±0.029)μmol·L^-1]均明显不同;与正常组相比,MCAO大鼠体内的灯盏乙素和芍药苷的Vmax和CLint均明显减少(P<0.05,P<0.01),灯盏甲素的Vmax也显著降低(P<0.05)。结论:辛芍组方的效应成分在脑缺血再灌注损伤大鼠肝微粒体中的代谢速率降低、消除减慢。

酶促反应动力学中抑制剂类型的判断方法

酶促反应动力学是研究酶的动力学性质的学科 ,是生物化学的重要内容 .本文拟通过使用 Mathe-matica软件对以碱性磷酸酶为催化剂 ,在一定初始反应物浓度条件下 ,不同时间及其对应的底物浓度进行线性回归 ,直线斜率即近似为初始时反应速率值 .以米氏方程为模型对多组初始底物浓度及其对应的反应速率组成的有序数组进行非线性回归 ,即得到碱性磷酸酶的 Vmax(最大反应速率 ,单位 mmol/( s· l) )与 Km(米氏常数 ,单位 mol/l)值 ,并推断出 KH2 PO4 对碱性磷酸酶的抑制作用类型 .这一方法改变传统的曲线直线化的处理过程 ,提高了实验结果的精度 .