含小鼠PPRE反应元件报告质粒的转化扩增

目的对含小鼠过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)报告质粒p4×PPRE-luc进行体外转化和扩增,为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供高纯度、高丰度的报告载体。方法取p4×PPRE-luc质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果经转化后获得了抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的p4×PPRE-luc质粒其A260/A280=1.84,浓度为750ng/μl。结论成功转化并扩增了p4×PPRE-luc质粒,为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供了高纯度、高浓度的报告质粒。

化学品体外生物合成途径设计、元件组装和应用

随着合成生物技术的发展,体外生物合成逐渐成为化学品合成的重要方式之一,具有环境友好、催化效率高、原子经济性好、可控性强等优点。途径设计是构建整个体外生物合成系统的关键所在,本文分析总结了体外生物合成中应遵循的两个重要原则,包括原子经济性原则和能量最优原则。利用生物大分子将酶元件组装构建成多酶复合体,可提高体外生物合成的反应速率、减少副反应的发生,本文介绍了用于酶元件组装的3类常见生物大分子,包括连接肽、蛋白支架、DNA等。通过近年来体外生物合成在大宗化学品(糖类化学品、有机酸类化学品以及醇类化学品等)生产中的应用案例的介绍,展示了体外生物合成在化学品合成中的应用前景。随着体外生物合成设计能力的不断提高,体外生物合成的途径设计将朝着智能化、高效化发展,化学品体外生物合成的效率也将逐步提高,有望涵盖所有化学品的生物合成,成为未来化学品合成的主要方式之一。

仔猪腹泻抗性相关特异表达ESTs的筛选(英文)

以久仰香猪、剑白香猪和长白猪 3个品种的脾脏为材料 ,以品种间同一组织不同的发病状态为对照 ,将DDRT PCR技术与银染法相结合进行差异显示研究 ,筛选与仔猪腹泻抗性相关的特异表达ESTs。在脾脏未发病RNA池中检测到 5条特异表达ESTs ,其中一条与Nck转导蛋白同源 ,一条与长散布元件反转录酶同源 ,一条为相似性较高的未知功能序列 。

对氨基苯甲酸拟二肽酯的简易合成及其抗糖尿病活性初步研究

以未保护的对氨基苯甲酸和氨基酸酯直接反应,一步法合成了9个未见报道的氨基酸修饰的对氨基苯甲酸衍生物(对氨基苯甲酸拟二肽酯),合成方法简捷,产物收率较高(78%～91%).产物的结构经IR,1HNMR,13CNMR,MS,HRMS表征和证实.初步的生物活性筛选结果表明,这些化合物抗糖尿病活性较弱.

4-(3-(4-羟基苯基)-3-氧代-1-芳基丙氨基)-N-(5-甲基异唑-3-基)苯磺酰胺的合成及其抗糖尿病活性

由磺胺甲唑、对羟基苯乙酮和芳香醛反应直接合成了13个未见报道的β-氨基酮,反应选择性发生在羰基α位。产物结构通过1HNMR、13CNMR、MS进行了表征。生物活性试验显示,低浓度范围,所得化合物不仅对蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)和α-葡萄糖苷酶有一定抑制活性,而且对过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件(PPRE)具有中等强度的激动活性,8个化合物的激动活性超过40%,其中化合物11的活性达到72.7%。

含磺胺嘧啶结构单元β-氨基酮的合成及其生物活性

通过原子经济的Mannich反应实现了磺胺嘧啶、1-萘乙酮与芳香醛三组分的连接,直接合成了16个含有磺胺嘧啶结构单元的未见报道的β-氨基酮;所得化合物经1H NMR、13C NMR、HRMS和MS等技术手段确证其结构。生物活性测试结果显示,在17.04~19.69 nmol/L浓度范围内,所有目标分子的α-葡萄糖苷酶抑制活性很弱,但部分目标分子的过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件（PPRE）激动活性较好,最高达到了52%。

替米沙坦上调肝细胞生长因子表达的分子机制研究

目的探讨替米沙坦对肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）表达的影响及其机制研究。方法选取体外培养大鼠肾系膜细胞，观察不同浓度（0．1μmol／L、1．0μmol／L、10．0μmol／L）替米沙坦干预24h对HGF表达的影响；采用双荧光素酶报告基因分析系统检测HGF启动子活性和替米沙坦的PPAR7反应性。非放射性蛋白激酶检测系统及Westernblot检测PKA、CREB、pCREB蛋白表达。结果与正常对照组相比，替米沙坦能明显增加HGF蛋白表达，该作用呈浓度依赖性（P〈0．05）；荧光素酶检测证实HGF基因的-290／＋20序列存在潜在PPAR7反应元件，10μmol／L替米沙坦显著增强HGF启动子活性（P〈0．05）。同时蛋白检测提示替米沙坦抑制系膜细胞PKA活性，下调pCREB蛋白表达。结论替米沙坦上调HGF表达独立于PKA／CREB信号通路，可能通过结合HGF启动子PPAR7反应元件上调HGF表达。

含萘丁美酮结构单元的β-氨基醇的合成及其抗糖尿病活性研究

以本课题组合成的含萘丁美酮结构单元的β-氨基酮为原料,采用硼氢化钾还原,简洁高效地合成了25个新型β-氨基醇化合物,其结构经IR、MS、1H NMR、13C NMR和HR-MS证实。体外抗糖尿病活性研究结果表明,多数β-氨基醇的抗糖尿病活性好于对应的β-氨基酮;化合物5hd1和5id2的α-葡萄糖苷酶抑制活性超过阳性对照物,分别达到74.37%和90.15%;5个化合物的过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件(PPRE)相对激动活性超过60%,其中化合物5ca的相对激动活性高达112.59%。化合物5hd1、5id2和5ca作为抗糖尿病先导分子值得进一步研究。

4-(3-(4-溴苯基)-3-氧代-1-芳基丙氨基)-N-(5-甲基异噁唑-3-基)苯磺酰胺的合成与抗糖尿病活性的初步研究

由磺胺甲噁唑、对溴苯乙酮和芳香醛反应合成了17个未见报道的β-氨基酮化合物,制备方法简便、反应条件温和,产物收率32%～90%。通过1HNMR、13CNMR、MS和HR-MS对目标分子进行了结构表征。生物活性试验显示,在低浓度范围,所得化合物不仅显示一定的蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)和α-葡萄糖苷酶抑制活性,而且具有中等强度的过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件(PPRE)的激动活性,7个化合物的激动活性超过40%,化合物12活性达到了66.35%,值得进一步研究。

阪崎克罗诺杆菌PCR-RFLP分型方法的建立

克罗诺杆菌是一种发现较晚的食源性致病菌。快速的分型方法对于食源性疾病暴发中致病菌的溯源和种内遗传变异具有重要的作用。本研究中,在充分考虑基因片段的长度、同源性、酶切位点及PCR扩增效率等因素的基础上,从65个候选基因(53个鞭毛相关基因和12个菌毛相关基因)中,筛选出2个菌毛相关基因(命名为P3和P4)作为限制性片段长度多态性(RFLP)分型的靶标基因。选择4种限制性内切酶,分别对2种基因进行限制性酶切,经非变性丙烯酰胺凝胶电泳和软件分析,对阪崎克罗诺杆菌进行8种PCR-RFLP分型,并分别构建系统树。将分型结果与BOX-PCR分型作比较,P3基因经限制内切酶HaeIII的分型结果与BOX-PCR分型结果具有较高的一致性。利用限制性内切酶HaeIII对P3基因进行酶切所建立的PCR-RFLP分型方法,可用于阪崎克罗诺杆菌的初步分型。

含尿嘧啶结构单元二肽衍生物的设计、合成及生物活性研究

为探索新型抗糖尿病分子,设计了含有尿嘧啶结构单元的二肽衍生物.以尿嘧啶、多聚甲醛和半胱氨酸为原料,经过两步反应获得关键中间体S-胸腺嘧啶-L-半胱氨酸(IM-2),再经氨基保护、羧基酯化和氨基酸偶联,顺利合成了16个二肽衍生物.所得目标化合物均经1H NMR、13C NMR和HRMS进行结构确认,并开展了过氧化物酶体增殖物受体反应元件(PPRE)激动活性、α-葡萄糖苷酶-rat抑制活性、二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制活性筛选.生物活性结果显示,这些二肽衍生物的PPRE相对激动活性、α-葡萄糖苷酶和DPP-4抑制活性都很弱;同时发现,该类分子的α-葡萄糖苷酶抑制活性变化趋势与PPRE激动活性、DPP-4抑制活性变化趋势相反,这为新型多肽多靶点药物的设计提供了新思路.

丹参酮Ⅱ_A通过激活PPARα减轻4-HNE诱导的肝细胞损伤的机制研究

丹参酮Ⅱ_A(tanshinoneⅡ_A,TanⅡ_A)是丹参主要的脂溶性有效成分,能够增强对脂质的代谢功能,降低血清中脂质过氧化物浓度,也具有抗氧化损伤、清除自由基及抑制肝内坏死炎症反应的作用,对肝功能损害预后起到保护作用。因此,研究TanⅡ_A保护肝功能的确切机制可以为TanⅡ_A防治肝损伤提供重要的理论与实验依据。该文主要通过体外细胞实验,研究TanⅡ_A减轻4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal,4-HNE)诱导的肝细胞氧化损伤的作用及机制。以正常肝细胞系NCTC 1469为细胞模型,建立4-HNE处理的肝细胞氧化损伤模型。通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放及Hoechst染色法检测TanⅡ_A对肝细胞氧化损伤的保护作用; Western blot法检测TanⅡ_A作用前后过氧化物酶增殖激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)及过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator response element,PPRE)的蛋白表达变化; Real-time PCR法检测其下游关键酶脂肪醛脱氢酶(fatty aldehyde dehydrogenase,FALDH)的基因表达变化。结果表明4-HNE可增加肝细胞LDH释放,降低细胞存活率,而TanⅡ_A能逆转4-HNE引起的肝细胞损伤。Western blot及Real-time PCR法检测结果显示4-HNE可显著下调肝细胞内PPARα及其下游FALDH的表达,增加细胞内4-HNE蛋白质水平,而经过TanⅡ_A处理后PPARα及FALDH的表达可显著提高,4-HNE蛋白水平也得到了降低。这揭示TanⅡ_A可逆转脂质氧化产物4-HNE引起的肝细胞损伤,其作用机制可能与激活PPARα特异性结合PPRE元件,激活下游FALDH的表达以及清除4-HNE有关,这可能是TanⅡ_A发挥治疗作用的关键机制之一。

余甘子提取物降血糖活性及其主要成分研究

为研究余甘子提取物的降血糖作用机制,本文研究了其对LO2细胞葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)m RNA表达及过氧化物酶体增殖物反应元件(PPER)和核转录因子kappa B(NF-κB)活性的影响。该实验采用D101大孔树脂柱对余甘子提取物进行初步分离,得到三个组分;采用Real-Time PCR和荧光素酶报告基因方法研究余甘子提取物及其有效组分对GLUT-2和PPARγm RNA表达和PPER和NF-κB荧光素酶活性。余甘子提取物可以显著升高GLUT-2和PPARγm RNA的表达和PPRE报告基因的活性,抑制脂多糖(LPS)诱导的炎症反应,可以降低NF-κB报告基因的活性,随着浓度的升高其抑制作用增强。大孔树脂柱30%乙醇洗脱物为其有效活性组分。通过Sephadex LH-20,ODS和制备HPLC等柱色谱技术分离鉴定了一个主要的成分为没食子酸;余甘子可能是通过升高GLUT-2和PPARγ的表达和抑制相关炎症通路发挥降血糖作用,没食子酸可能为其主要的活性成分。

地黄引子改善AD大鼠脑组织线粒体生物合成与氧化损伤的机制

目的：探讨地黄饮子对阿尔茨海默病（AD）大鼠中枢神经线粒体生物合成能力、氧化损伤保护的作用机制以及对AD大鼠学习记忆能力的改善作用。方法：120只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、安理申组、地黄饮子高、中、低剂量组,除假手术组外均侧脑室注射β-淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）建立AD模型,各治疗组给予相应药物灌胃,假手术组和模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃,每天1次,连续30 d。通过大鼠避暗箱实验,Y迷宫实验对大鼠行为学进行观察。行为学实验后,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）表达量和环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）磷酸化水平;测定脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ活性;测定丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果：地黄饮子可显著改善AD大鼠学习记忆和工作记忆能力。与模型组比较,在避暗箱实验中,地黄饮子可使AD大鼠的停留潜伏期明显增加（P〈0.05,P〈0.01）,而错误次数显著减少（P〈0.05,P〈0.01）;Y迷宫实验中,地黄饮子可显著提高AD大鼠自发交替反应率（P〈0.05,P〈0.01）。地黄饮子显著增加AD大鼠脑组织PGC-1α表达量和CREB磷酸化水平,显著提高脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ,Ⅲ和Ⅳ活性（P〈0.01）,而对呼吸链复合物Ⅱ活性无显著作用。地黄饮子能显著降低AD大鼠脑组织MDA含量（P〈0.01）,提高抗氧化酶类SOD和GSH-Px活性（P〈0.05,P〈0.01）。结论：地黄饮子通过激活AD大鼠CREB/PGC-1α信号通路,提高线粒体生物合成能力,增加线粒体呼吸链酶系活性,改善线粒体功能损伤,同时通过增强抗氧化酶系活性,发挥提高机体抗氧化损伤,从而改善AD大鼠学习记忆和工作记忆能力。

孕中期母鼠丙泊酚麻醉手术对子代学习记忆的影响

探讨丙泊酚暴露引起的大鼠子代学习和记忆的影响。方法:36只成年清洁级SD雌性大鼠和12只雄性大鼠随机分成12组,每组3只雌鼠1只雄鼠。雌鼠怀孕14 d后随机分为2组对照组(n=18)、丙泊酚组(n=18),对照组:颈内静脉注射生理盐水2 ml/(kg.h);观察4小时;丙泊酚组:颈静脉注射1%的丙泊酚,按照2 ml/(kg.h)速度麻醉4 h。每组随机选12只血压、心率、血氧饱和度正常的孕鼠继续妊娠。对出生30 d的雄性子鼠行Morris水迷宫实验(MWM)(n=30)。于48 d处死各组子鼠取海马组织。蛋白免疫印迹法检测HDAC2、p-HDAC2、CREB、p-CREB、NR2B蛋白的表达。中性红染色法评估对照组及丙泊酚组海马组织神经元丢失。结果:与对照组比较,丙泊酚组子代大鼠的逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,海马区组织中的HDAC2和p-HDAC2的蛋白表达上调(P<0.05),而p-CREB和NR2B的蛋白表达下调(P<0.05),海马组织神经元缺失程度增加(均P<0.05)。结论:丙泊酚对孕中期大鼠的子代学习及记忆能力有影响,海马区HDAC2和p-HDAC2的蛋白表达上调,而p-CREB和NR2B蛋白下调,海马组织神经元缺失程度增加。

大柴胡汤通过CREB/PGC-1α通路保护营养型肥胖大鼠肝脏粒体功能

目的:观察大柴胡汤对营养型肥胖大鼠环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子α(PGC-1α)通路的作用及肝脏线粒体的保护机制。方法:8周龄SD雄性大鼠120只,随机分为正常组20只和造模组100只。正常组给予大鼠维持饲料喂养,造模组给予高脂饲料喂养。造模成功大鼠随机分为模型组、阳性药(二甲双胍)组、大柴胡汤低、中、高剂量组(4.25,8.5,17 g·kg^(-1)),每组20只。电子天平称取并比较各组大鼠体质量,计算Lee’s指数,分光光度法检测肝脏线粒体膜电位,电镜检测线粒体超微结构,蛋白免疫印迹法检测PGC-1α蛋白表达和CREB磷酸化作用。结果:与正常组比较,模型组大鼠体质量及Lee’s指数显著增加(P<0.01),线粒体膜电位显著下降,PGC-1α蛋白表达和CREB磷酸化水平显著下降(P<0.01);与模型组比较,大柴胡汤能够明显降低肥胖大鼠体质量和Lee’s指数(P<0.05,P<0.01),提高肝脏线粒体膜电位(P<0.05,P<0.01)和保护线粒体结构完整性,上调PGC-1α蛋白表达和促进CREB磷酸化(P<0.05,P<0.01)。结论:大柴胡汤激活CREB/PGC-1α通路,保护线粒体结构与功能,有效抑制肥胖大鼠体质量增加。

脑心安胶囊激活CREB/PGC-1α改善慢性脑缺血致VCI大鼠线粒体及氧化损伤的作用机制

目的:以慢性脑缺血致血管性认知障碍(VCI)大鼠为模型,探究脑心安胶囊对VCI大鼠脑组织线粒体功能障碍及其导致的氧化损伤的保护作用。方法:150只大鼠采用随机数字法分为造模组(130只)和假手术组(20只),以双侧颈动脉结扎法(2-VO)造模,制成慢性脑缺血大鼠模型。经筛选,将造模组中VCI造模成功的87只大鼠,随机分为模型组、阳性药组(安理申,0.5 mg·kg^(-1)),脑心安胶囊低、中、高剂量组(0.18、0.36、0.72 g·kg^(-1)),每组17~18只大鼠。经灌胃给予脑心安胶囊8周后,采用大鼠新物体识别和Y迷宫实验测定脑心安胶囊对VCI大鼠学习记忆和工作记忆的影响。以免疫荧光染色法测定大鼠脑组织8-氧鸟嘌呤(8-OxoG)含量,分光光度法测定大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性、线粒体的肿胀度、线粒体膜电位、丙酮酸脱氢酶(PDH)和α-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)活性,电镜观察大鼠脑组织线粒体亚显微结构,蛋白免疫印迹法(Western blot)测定脑组织环磷腺苷酸反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子-1(NRF-1)和线粒体转录因子A(mt-TFA)蛋白表达水平,光化学法测定大鼠线粒体状态ⅣHO生成和脑内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠新物体辨别指数和Y迷宫自发交替反应率显著下降(P<0.01),脑组织ROS生成量明显增加(P<0.01),线粒体膜电位和肿胀度A值显著下降(P<0.01),线粒体明显肿胀,电镜观察显示脑组织线粒体出现显著的空泡、嵴断裂等亚显微结构结构损伤,CREB磷酸化水平和PGC-1α、NRF-1和mt-TFA蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),脑组织中PDH、KGDH活性和线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性均明显下降(P<0.01),线粒体状态ⅣHO生成显著增加(P<0.01),MDA含量明显升高(P<0.01),SOD及GSH-Px活性均显著降低(P<0.01)。与模型组比较,脑心安胶囊各剂量均能够明显提高VCI大鼠新物体辨别指数(P<0.05,P<0.01)和自发交替反应率(P<0.05,P<0.01),减少脑组织ROS生成量(P<0.01),提高线粒体膜电位和肿胀度A值(P<0.05,P<0.01),减少线粒体肿胀程度和线粒体亚显微结构损伤,提高CREB磷酸化水平和上调PGC-1α、NRF-1和mt-TFA蛋白表达(P<0.05,P<0.01),提高PDH、KGDH和线粒体呼吸链复合物Ⅲ、Ⅳ的活性(P<0.01),降低线粒体状态ⅣHO生成量(P<0.01),降低MDA含量(P<0.05,P<0.01),提高SOD及GSH-Px活性(P<0.01)。结论:脑心安胶囊通过激活CREB/PGC-1α通路,保护线粒体结构、功能,提高机体抗氧化能力,抑制慢性脑缺血诱导的线粒体功能障碍及其氧化损伤,改善慢性脑缺血导致的大鼠血管性认知障碍。