鸡蛋中泰妙菌素化学发光酶免疫分析方法研究

针对鸡蛋中泰妙菌素的残留问题,通过半抗原及抗原设计合成、动物免疫及细胞融合筛选,成功得到可特异、灵敏识别泰妙菌素的单克隆抗体,并建立了泰妙菌素的化学发光酶免疫分析方法(CLEIA)。采用棋盘法结合单因素实验优化策略,确定最佳反应条件为:包被原质量浓度0.26µg/mL,抗体质量浓度0.94µg/mL,反应体系为0.02 mol/L的PBS(pH 7.4)缓冲液,酶标二抗质量浓度及其稀释液和反应时间分别为2µg/mL、PBST和40 min。在该条件下,建立了泰妙菌素的CLEIA方法,其IC_(50)为0.54 ng/mL,检出限(LOD,IC_(10))为0.03 ng/mL,线性检测范围(IC_(20)~IC_(80))为0.17~1.74 ng/mL,且与其它功能结构类似物无明显交叉反应,特异性良好。将建立的CLEIA方法用于鸡蛋实际样品的检测,加标回收率为100%~118%,相对标准偏差(RSD)小于10%,结果与HPLC-MS/MS(r^(2)=0.9987)一致,表明该方法适用于鸡蛋样品中泰妙菌素残留的快速筛查。

探究酶联免疫分析方法在食药安全检测中的应用前景

酶联免疫吸附分析作为一种新型检验检测分析技术,具有高效、快速、高通量等优点,因此在食药安全监测、环境污染控制、医疗卫生等领域得到广泛应用,主要用于食药中农兽药残留的测定,关键控制点(半抗原的制备、人工抗原的合成、抗体的制备)。本文着重介绍酶联免疫分析技术的原理和方法建立,分析酶联免疫分析技术在食药安全检测中的现状,并就酶联免疫分析技术检测农药残留存在的现实问题和应用前景。

间接竞争酶联免疫分析用于薏苡仁中杂色曲霉毒素的快速检测研究

杂色曲霉毒素(Sterigmatocystin,ST)是一种主要由杂色曲霉和构巢曲霉等真菌产生的次级代谢产物,其结构与黄曲霉毒素相似,具有潜在的致癌性和毒性,严重危害人类生命健康。研究发现部分中药易ST污染,但目前针对中药中ST的快速检测研究相对较少。通过系统优化样品前处理条件及影响检测灵敏度的关键参数,建立了简便的间接竞争酶联免疫分析法(ic-ELISA),用于消费量较大的药食同源薏苡仁中ST的快速筛查。所建立ic-ELISA的半数抑制浓度(Half-Maximal Inhibitory Concentration,IC 50)为0.11 ng/mL,线性范围为6.25~100μg/kg,加标回收率在79.27%~99.95%之间,相对标准偏差(RSD)<12%。此外,该方法可抗基质干扰,只需利用溶剂标准曲线即可进行定量。用所建立的ic-ELISA对96批薏苡仁样品进行了检测,并用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对阳性样品进行了确证。该ic-ELISA快速、准确、经济,可作为薏苡仁中ST高通量快筛的技术手段,同时为其他中药中ST的快速检测提供参考。

间接竞争酶联免疫分析方法检测花生中黄曲霉毒素B1

目的:针对花生中强毒性污染物黄曲霉毒素B1(AFB1)建立了一种准确、灵敏的间接竞争酶联免疫分析方法(ic-ELISA)。方法:制备了AFB1包被抗原,包被量为0.1μg/孔;抗体稀释64000倍;选用0.1%脱脂乳粉为方法封闭液,0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)为样品稀释液;结果:在最优的试验条件下,建立的ic-ELISA对目标物AFB1的检测线性范围为0.0097~0.088μg/L(R2=0.999);灵敏度(IC50)和检出限(IC15)分别达到0.027μg/L和0.0066μg/L。板内变异系数(n=6)为0.29%~16.9%,板间变异系数(n=6)为0.22%~21.19%。在花生样品中AFB1的检测灵敏度(IC50)为1.04μg/kg,回收率为96.67%~106.51%。结论:本研究建立的ic-ELISA方法操作相对简便,检测灵敏度高、准确性好,可稳定地用于花生样品中AFB1污染物的定量分析检测。

以赭曲霉毒素A单克隆抗体建立竞争酶联免疫吸附分析方法的研究

本研究通过活性酯法合成赭曲霉毒素A人工抗原,免疫小鼠制备单克隆抗体,在此基础上建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200～6000pg/ml,检测下限为150pg/ml。单抗与赭曲霉毒素B的交叉反应率为35%,与桔霉素、黄曲霉毒素B1和展青霉素等毒素交叉反应低于0.01%。在小麦样品中的加标回收率为83%～116%,变异系数为9.4%～19.8%。测试23份样品,赭曲霉毒素A的含量在0.6～2.56μg/kg之间。

层粘连蛋白酶联免疫分析方法的建立及初步应用

目的 建立酶联免疫吸附试验 ,对层粘连蛋白进行定量检测。方法 将鼠抗人层粘连蛋白单克隆抗体包被于聚苯乙烯微孔板 ,兔抗人层粘连蛋白抗体作第一抗体 ,酶标羊抗兔抗体作为第二抗体 ,在对有关试验条件进行优化后 ,检测 73份献血员标本。结果 本法的标准曲线为 2 5～ 16 0 0ng/ml,但在 5 0～ 80 0ng/ml范围内线性理想 ,其线性回归系数大于 0 .95。批内和批间变异系数分别为 8.6 %和 9.3% ,灵敏度为 2 5ng/ml,平均回收率为 98.1%。 17份样品用本方法与放射免疫法同时检测 ,其相关系数为 0 92 96。 73例献血员血清层粘连蛋白水平为 (115 .7± 17.3)ng/ml。结论 本方法可替代放射免疫法 。

前列腺抗原酶促化学发光免疫分析方法学的建立

应用鲁米诺-过氧化氢发光体系建立定量测定血清前列腺特异性抗原含量的酶促化学发光免疫分析方法。该方法测量范围为1.5～80μg/L,灵敏度为0.12μg/L,批内变异<5%,批间变异<15%。回收率为83.8%～118.7%,稀释实验测定值与稀释度呈线性相关,相关系数为0.999。本方法与免疫放射分析方法的相关方程y=1.07x+0.68,相关系数r=0.97。

间接竞争酶联免疫分析方法检测青霉素G

本研究介绍了青霉素G残留的危害,并建立了间接竞争酶联免疫分析方法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测牛奶类样品中青霉素G的残留量。首先制备出青霉素G的单克隆抗体,在最优实验条件下,青霉素G浓度范围在1~1000 ng·mL^(-1)内,所建立方法的灵敏度(IC_(50))为17.33 ng·mL^(-1),检出限为0.75 ng·mL^(-1)。该抗体与苄星青霉素交叉反应率为30.09%,而与氨苄青霉素、羧苄青霉素、阿莫西林、先锋霉素、头孢噻肟钠均无交叉反应。牛奶类样品中青霉素G的加标回收率为81.70%~99.08%,相对标准偏差为1.82%~11.41%。以上结果表明,本研究建立的间接竞争酶联免疫吸附分析方法有较高的灵敏度和较强的特异性,可以用于青霉素G的检测。

游离前列腺特异性抗原酶促化学发光免疫分析方法学的建立

采用双抗体夹心法建立了定量测定血清游离前列腺特异性抗原含量的酶促化学发光免疫分析方法,其中,1株抗总前列腺特异性抗原的单克隆抗体作为包被抗体,另1株抗游离前列腺特异性抗原的单克隆抗体作为标记抗体。总测量范围为0.2^10 ng/mL,灵敏度为0.01 ng/mL,批内变异〈10%,批间变异〈20%。本方法与Monobind游离前列腺特异性抗原化学发光测定试剂盒比对的相关方程为y=0.72x-0.22,相关系数r=0.90。

磺胺二甲嘧啶抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立

应用人工合成免疫原免疫动物、杂交瘤融合技术制备出抗磺胺二甲嘧啶的单抗及多抗。抗体亲和常数均大于1.0×108L/mol。利用多抗2510建立酶联免疫分析方法。该方法测量范围为0.1^30 ng/mL,灵敏度为0.08 ng/mL,批内变异〈15%,批间变异〈21%。不同样品回收率在80.5%^137.8%之间,稀释实验测定值与稀释度呈线性相关,相关系数为0.997。

酶联免疫分析方法测定动物性食品中西马特罗残留

目的建立检测西马特罗药物残留的酶联免疫分析方法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。方法对主要影响因素,包括包被原稀释倍数、抗体稀释倍数、竞争时间、标准品稀释液pH等参数进行优化,对样品进行前处理,经提取净化后进行检测,并对ELISA检测结果与仪器方法进行对比。结果西马特罗ELISA方法的最佳反应条件为:抗原稀释倍数为100000,抗体稀释倍数为150000,标品稀释液pH为7.5,竞争反应时间为20 min。在最佳反应条件下,绘制标准曲线,西马特罗的IC50为1.32μg/L,线性范围为0.16~6.95μg/L,检出限为0.09μg/L。西马特罗在0.16、0.32、1.6μg/kg添加水平的回收率分别为80.31%~113.81%,变异系数低于10%,且实际样品的测定结果与超高效液相串联质谱法的相关性良好(r2=0.9962)。结论本研究建立的ELISA方法具有较高的灵敏性,适合西马特罗残留检测。

基于特异性对硫磷单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附分析方法建立

【目的】制备特异性识别对硫磷(PA)的单克隆抗体,建立其间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA),为实现对硫磷的农残快检提供技术支持。【方法】以化合物4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸为半抗原,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备人工抗原,免疫7周龄Balb/c雌性小鼠,取抗血清效价最高、特异性最优小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接酶联免疫方法(i-ELISA)及ic-ELISA分别评价融合细胞株的阳性和特异性,通过有限稀释法筛选稳定分泌对硫磷抗体的单克隆细胞株。再通过棋盘格试验筛选出抗原抗体最佳工作浓度组合建立对硫磷ic-ELISA标准曲线,并基于对硫磷单克隆抗体与各结构类似物的交叉反应率,评估ic-ELISA的特异性。采购西红柿样品进行对硫磷的添加回收试验,运用气相色谱法(GC)验证ic-ELISA的准确性。【结果】成功合成对硫磷人工抗原PA-BSA和PA-OVA,经5次免疫后融合小鼠的血清效价为8×103;通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、特异性最强的对硫磷单克隆细胞株4F11A10。以2μg/mL包被抗原PA-OVA、0.25μg/mL细胞株4F11A10分泌抗体为最佳抗原抗体工作浓度组合,建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线,其半抑制浓度(IC50)为50 ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为2.34~300 ng/mL;所建立的对硫磷ic-ELISA与5种有机磷农药(丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷)均无交叉反应。对比ic-ELISA和GC测定西红柿样品中对硫磷的添加回收试验结果,发现ic-ELISA的添加回收率为84.86%~100.27%,GC的添加回收率为97.60%~106.40%,两种方法的检测结果一致性较好。【结论】建立的ic-ELISA可用于快速检测蔬菜、水果等农产品中的对硫磷残留。

食品中桔霉素的酶联免疫分析方法研究进展

综述了桔霉素的理化性质、其在食品中的存在及危害、酶联免疫方法的基本原理及食品中桔霉素的酶联免疫吸附分析方法的研究现状,重点介绍了桔霉素人工抗原的合成方法,抗桔霉素抗体的制备原理,以及桔霉素的酶联免疫吸附分析方法的建立.

氟乐灵抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立

该研究针对农(水)产品中氟乐灵农药残留的问题,建立了间接竞争酶联免疫分析方法,快速检测氟乐灵农药。利用3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯与仲胺侧链氨基反应合成半抗原2C,采用碳二亚胺法将半抗原2C与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联合成完全抗原。通过免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体Pc Ab-2C,基于间接竞争酶联免疫分析方法原理对包被原和抗体的稀释倍数、包被温度、抗体和标准品稀释液等7个因素进行系统优化,最终建立间接竞争酶联免疫分析方法。结果表明:该方法的IC_(50)为54.07 ng/mL,最低检测限为7.22 ng/mL,线性范围为12.56~282.62 ng/mL,与20种氟乐灵结构类似物进行交叉反应,只有2种药物的交叉反应率大于15%,方法特异性良好;对大豆、大豆油和鳗鱼等样品进行检测,添加回收率为89.8%~106.4%,变异系数小于10%。采用气相色谱法进行验证,添加回收率为89%~108.2%,变异系数小于10%,两种方法测定结果呈现良好的线性关系(R^(2)=0.99)。该研究所建立的方法具有灵敏度强、特异性强、准确度高等优点,适用于农(水)产品中氟乐灵农药残留的高通量快速检测。

β-Casomorphin-7的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法的建立

β-酪啡肽-7(β-Casomorphin-7)是一个有代表性的乳源外啡肽,有调节动物消化道运动和采食、内分泌、免疫等多种生物学功能。本研究以β-Casomorphin-7与人血清白蛋白(HSA)经戊二醛交联的复合物作为包被抗原;一抗为鸡抗β-Casomorphin-7与牛血清白蛋白(BSA)交联复合物的抗血清;酶标二抗为兔抗鸡IgG经戊二醛与辣根过氧化物酶(HRP)交联的复合物。包被抗原和一抗的稀释度经方阵稀释实验确定。本实验所建立的竞争ELISA方法的孔间差异为3.3%,板间差异为8.6%,检测灵敏度20ng/ml,检测范围20～320ng/ml,在实验浓度范围内。β-Casomor-phin-7的抗血清与β-内啡肽、脑啡肽、强啡肽、精氨酸降压素和神经降压素等活性肽未显示免疫交叉反应。表明所建立的方法有较高的特异性,可用于酪啡肽的体内功能研究。

基于QuEChERS样品前处理的间接竞争酶联免疫分析法快速检测薏苡仁中黄曲霉毒素B_(1)

目的解决间接竞争酶联免疫分析法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)检测薏苡仁中黄曲霉毒素B_(1)(Aflatoxin B_(1),AFB_(1))的基质干扰问题,建立一种简便的高通量检测方法,用于薏苡仁中AFB_(1)的快速筛查。方法以ic-ELISA的显色值和抑制率为评价指标优化样品前处理过程,重点考察QuEChERS萃取净化技术、不同稀释溶剂和稀释方式消除基质效应的效果,并对建立的方法进行方法学考察,最后应用于薏苡仁实际样品检测,检测结果用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进行确证。结果建立了一种无需任何校正,可用溶剂标准曲线进行定量分析的ic-ELISA。方法的半数抑制浓度为0.074 ng/mL,线性范围为1.37~20.0μg/kg,加标回收率在75.12%~84.46%之间,RSD小于6%。122批薏苡仁及其相关样品中AFB_(1)的阳性率为20.5%,阳性样品的超标率为24.0%,污染水平为1.76~27.56μg/kg。ic-ELISA与LC-MS/MS检测结果的相关系数(r)为0.98。结论QuEChERS萃取净化技术能够有效去除薏苡仁中的干扰成分,对快速样品前处理方法的建立具有重要应用价值,结合本研究所建立的ic-ELISA,为薏苡仁中AFB_(1)的检测和监测提供简便有效的技术手段。

氯丙嗪抗体制备与酶联免疫吸附测定方法的建立

本研究针对动物性食品中违禁药物氯丙嗪残留问题,建立了针对氯丙嗪的酶联免疫吸附测定方法。首次通过以氯丙嗪为原料,先去甲基化合成N-甲基氯丙嗪,再与丙烯酸叔丁酯反应及水解等步骤成功合成了氯丙嗪半抗原(CPZ-H)。半抗原CPZ-H分别与OVA和BSA通过活泼酯法偶联合成包被原与免疫原,采用免疫原CPZ-H-BSA免疫新西兰大白兔成功制备了特异性的抗氯丙嗪的多克隆抗体。基于该抗体建立了快速测定氯丙嗪的间接竞争酶联免疫吸附测定方法(ic-ELISA)。通过优化ic-ELISA方法的最佳工作条件,确定包被原和抗体稀释倍数均为1:8000时效果最好,此时标准曲线的IC50为1.1 ng/mL,线性范围为:0.13 ng/mL^8.8 ng/mL。制备的抗氯丙嗪的多克隆抗体与其它氯丙嗪类似物无交叉反应,特异性好。本研究为今后高特异性氯丙嗪快速检测试剂盒的制备提供依据。

均相酶免疫分析简述

本文简要叙述与阐明均相酶免疫分析方法的产生、特点、测定原理、酶及酶标记并分析其优缺点。对均相酶免疫分析用商品试剂盒及应用领域亦作扼要介绍。

单克隆抗体酶联免疫方法检测人血清胰岛素原及其应用

目的:建立灵敏、特异的检测人血清中胰岛素原的酶联免疫吸附试验并应用于临床与流行病学研究. 方法:选择2种mAb并引入生物素与亲和素放大系统来建立酶联免疫分析方法,一种抗C肽mAb结合到酶反应板上作为固相抗体,另一种生物素标记的抗胰岛素抗体作为液相抗体,将该检测方法应用于流行病学研究(n=1196). 结果:本法灵敏度0.83 pmol/L,与1 200 pmol/L胰岛素、3 960 pmol/L C肽无交叉反应,线性标准范围0.83-142 pmol/L.批内变异系数小于11.4%,批间变异系数小于11.2%.流行病学研究结果显示胰岛素原的含量与体重指数、腰围、收缩压、舒张压、胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、危险因素数目呈正相关, 与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关. 结论:本法适用于在临床研究及流行病学研究中检测人血清中胰岛素原的含量.β细胞功能受损与纤溶功能的紊乱可能是高胰岛素原与心血管危险因素关联的原因.

基于循环富集辣根过氧化物酶的新型荧光免疫检测体系

提出了一种基于循环富集辣根过氧化物酶的用于检测人IgG的新型荧光酶免疫检测体系。脱硫生物素与亲合素的结合常数比较小,当其与亲合素结合后,在生理条件下即可被生物素取代,利用此取代反应可对辣根过氧化物酶进行循环富集。当用缓冲液代替抗原进行实验时,发现即使循环富集达到7次所产生的背景信号也相当低,这种特性使得该方法可检测到0.05ng/mL人IgG。