牛病毒性腹泻-黏膜病病毒斑点酶联免疫吸附检测法的建立

采用辛酸-硫酸铵法提取兔抗BVDV高免血清中的免疫球蛋白IgG,在混合硝酸纤维素膜上进行间接酶联免疫吸附试验,建立了检测BVDV抗原的斑点酶联免疫吸附检测法。结果显示,抗体最佳包被量为400μg/mL,酶标记羊抗兔IgG的最佳工作浓度是1:500倍稀释,抗原最小检出量是5.36μg/mL。应用建立的检测方法对78份腹泻奶牛血样进行了检测,阳性检出率为58.97;经卡方(χ2)检验分析,建立的间接Dot-ELISA与AGP法相比较,阳性检出率差异显著。证实该方法敏感性高、简便快速,适合于基层兽医的检测诊断。

治疗型双质粒HBV DNA疫苗对食蟹猴免疫功能的影响

目的评价治疗型双质粒HBV DNA疫苗(简称HBV DNA疫苗)诱导食蟹猴HBV特异性体液免疫和细胞免疫的效果。方法30只食蟹猴随机均分为5组(雌雄各半),分别重复肌注高剂量2000μg/kg、中剂量660μg/kg、低剂量200μg/kgEP介导HBV DNA疫苗,330μg/kg EP介导的佐剂质粒和PBS对照。在不同时间点以酶联免疫吸附法(ELISA)及酶联免疫斑点法(ELIS-POT)检测其血清抗-HBs水平并计数外周血单个核细胞(PBMCs)HBsAg特异性分泌IFN-γ的T细胞频数。结果食蟹猴接种不同剂量HBV DNA疫苗后第10周起均产生不同滴度的特异性抗体。16周时EP介导的HBV DNA疫苗高、中、低剂量组各3只食蟹猴中分别有3、2、3只HBsAg特异性IFN-γT细胞计数阳性;29周时高、中、低剂量组全部动物应答呈阳性,其计数结果分别为30.0±13.5SFCs/3×105PBMCs,30.7±26.3SFCs/3×105PBMCs及17.7±6.4SFCs/3×105 PBMCs;而相同时间点佐剂组和PBS对照组3只食蟹猴均为阴性。结论EP介导的HBV DNA疫苗能有效诱导食蟹猴产生HBsAg特异性体液和细胞免疫应答。

柑橘褪绿矮缩病毒dot-ELISA检测方法的建立及应用

【目的】柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)是一种新的柑橘病毒,为给我国柑橘脱毒苗木质量控制和田间监测提供技术支撑,建立了一种灵敏度高、特异性强的快速检测方法。【方法】通过序列分析和相似性比对,明确抗原靶标;构建CCDaV-CP的原核表达载体,诱导目的蛋白表达后作为抗原用于注射兔子,制备抗血清。运用Western blot检测效价。通过优化抗体浓度,建立CCDaV的dot-ELISA检测方法,明确其灵敏度,并用于田间疑似样品检测。【结果】以外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,成功构建了表达载体pET28a-CCDaV-CP,其在18℃,IPTG浓度0.5 mmol·L^(-1)时,诱导12 h,目的蛋白的表达量高。制备的特异性抗血清效价为1:3000。由此建立的dotELISA检测方法在提取液被稀释640倍时,仍能检测出CCDaV。应用该方法对42份田间疑似样品的检测结果与PCR法的符合率为94.73%。【结论】首次获得了CCDaV的抗血清,并以此建立了快捷、灵敏、准确的dot-ELISA检测方法,为CCDaV的快速检测和防控提供了技术支撑。

鼻咽癌病人和正常人群中EB病毒特异性T细胞对靶抗原的识别和应答

为探讨痘苗病毒表达的Epslein Barr病毒 (EBV)核抗原 1、4(EBNA1、4)和潜伏膜蛋白 1、2 (LMP1、2 ) ,在不同人群的特异性T细胞引起的特异性T细胞杀伤 (CTL)中的作用 ,采集EBV阴性正常人、未经治疗的鼻咽癌 (NPC)病人和EBV IgA/VCA阳性者各 10人的周围血淋巴单核细胞 (PBMC) ,用EBV转化B淋巴细胞 ,建立类淋巴母细胞 (LCL)。用LCL刺激自体的T淋巴细胞作为效应细胞 ,以LCL感染重组痘苗病毒表达的EBNA1、4和LMP1、2为靶细胞 ,以51Cr释放法检测EBV特异性CTL所识别的靶抗原。结果表明 ,EBV LMP1、2可能既是EBV特异性T细胞的刺激抗原 ,又是其识别的靶抗原。将采集的 30例试验者的各 5株单克隆T细胞株分别检测HLA Ⅰ型(A、B、C) ,按照不同型别寻找相对应的EBNA1、4和LMP1、2的不同合成肽 ,应用酶免疫吸附斑点法 (Elispot)检测EBV特异性CD8+ 的CTL应答。结果显示 :10例正常人中 9人有特异的LMP2应答 ,4人有特异的EBNA4应答 ;10例未治疗的NPC病人中 3人有特异的LMP2 ,2人有特异的EBNA1,3人有特异的EBNA4应答 ;在 10例EBV-IgA/VCA阳性中 ,6人有特异的LMP2 ,5人有特异的EBNA4应答。

中国不同人群中T细胞对EB病毒潜伏膜蛋白2的识别

采集我国广东、广西和北京地区 ,鼻咽癌病人、EBV IgA/VCA阳性和正常人各30例的外周血标本 ,按照已确定的受HLA限制的潜伏膜蛋白2(LMP2)的CTL表位 ,合成在中国人群中常见的HLA A2、A11、A24、B40短肽 ,应用酶免疫吸附斑点法(Elispot) ,检测EBV特异性CD +的CTL应答。结果表明 :30例正常人中27人有特异性LMP2应答 ,在EBV IgA/VCA阳性的30人中17人对LMP2识别 。

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)Van Roekel株作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法(IFA)和免疫组织化学法鉴定,经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2,制备了腹水,并利用该单克隆抗体初步建立了Dot-ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。