人工智能辅助的酶分子改造应用进展

天然酶在活性、对映体选择性或热稳定性等方面经常难以满足应用与研究的需求,探索高效的酶分子改造技术改善该类酶的某些特性是酶工程的重要任务。酶分子改造技术主要包括理性设计、定向进化和人工智能辅助设计等。定向进化和理性设计是由实验驱动的酶分子改造策略,已经成功地应用于酶工程,但由于蛋白质序列空间的尺寸巨大以及实验数据少,现行的酶分子改造方法仍然面临着重大挑战。随着新一代测序、高通量筛选方法、蛋白质数据库和人工智能技术的发展,数据驱动的酶工程有望应对这些挑战。其中,采用人工智能辅助的统计学习方法,通过数据驱动方式构建序列/结构-酶性能的预测模型,依据预测模型挑选优良突变酶,大大提高了酶分子改造效率。基于酶分子改造的应用需求,本文综述了人工智能辅助酶分子改造的数据采集方法以及人工智能辅助酶分子改造的应用实例等,重点叙述了采用卷积神经网络预测蛋白质热稳定性的方法,以期为该领域的研究人员提供参考。

微生物产角蛋白酶及其应用

角蛋白是地球上丰度最高的纤维状蛋白质,其结构稳定,不易被蛋白酶水解,因此角蛋白的回收再利用受到限制。角蛋白酶能特异水解角蛋白,将角蛋白废弃物转变成有价值的产物,如肥料及土壤修复剂、饲料原料、绿色能源、絮凝剂以及护肤品成分等;角蛋白酶还可直接用于医药、皮革加工、洗涤剂成分、纺织和重金属回收等领域。本文综述了角蛋白酶的来源、分类和性质,通过定向进化或理性设计对酶分子进行改造,以改变酶对底物的特异性,提高酶的催化效率,提高酶对极端pH、高温、盐和化学试剂等的耐受性;介绍了酶的高效表达育种和发酵工艺优化及角蛋白酶在农业、环境保护、纺织行业、化妆品行业及医药行业的应用;最后对角蛋白酶的发展前景做了展望。

差异柠檬酸杆菌GXW-1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及分子改造

【目的】筛选鉴定1株产β-葡萄糖苷酶的菌株,克隆、表达该菌株中的β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行分子改造。【方法】在自然界中采集土样,筛选到1株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株,对野生菌进行16S rDNA鉴定,比对分析Gen Bank数据库中与野生菌同属的β-葡萄糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因保守区;设计引物扩增目的基因,以pQE30为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;采用镍亲和层析对重组酶进行纯化,研究其酶学性质;采用易错PCR和定点随机突变相结合的方法对野生型β-葡萄糖苷酶进行分子改造。【结果】一个来自于差异柠檬酸杆菌GXW-1的β-葡萄糖苷酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶CBGL的最适温度为45°C,最适p H为6.0,V_(max)值是(0.1704±0.0073)μmol/(mg·min),K_(cat)值为(0.2380±0.0102)/s。CBGL能水解α-pNPG、甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。对野生酶进行分子改造,获得V_(max)是野生酶2.54倍的突变体W147F。【结论】CBGL不仅具有β-1,4-糖苷键水解能力,还可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性。此外,CBGL还能够水解天然底物甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。

Bacillius naganoensis普鲁兰酶基因的分子改造及酶学性质研究

目的：通过缺失原酶上氨基酸残基，提高普鲁兰酶的酶活，并对其突变体重组酶进行酶学特性研究。方法：以Bacillius naganoensis基因组DNA为模板，PCR扩增大小为2781bp的普鲁兰酶编码基因，并通过PCR方法缺失原酶上的前78个氨基酸残基，获得突变体PulA234，将编码基因酶切连接到表达载体pET-22b（＋），转化Escherichia coli BL21（DE3）。IPTG诱导表达后对表达产物进行SDS—PAGE和酶学特性研究。结果：突变体发酵液的酶活是原酶的19倍，SDS—PAGE电泳结果显示有明显特异性条带，分子质量约为100kDa。该突变酶的最适反应温度为60℃，最适pH为4．75，在pH3．8～6．6范围内活性稳定，cu2＋、ca2＋对酶活有激活作用。结论：经改造的重组酶酶活力有所提高，具有良好的pH和酸稳定性，为普鲁兰酶酶制剂工业化生产及应用奠定基础。

链霉菌GXT6 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及葡萄糖耐受性分子改造

【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造。【结果】从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40°C,最适p H为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741)μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307)mmol/L。该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷。还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究。其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍。【结论】本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。