鳜传染性脾肾坏死病毒的纯化和酶切分析

鳜传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）是近年来危害广东地区鳜养殖业的主要病原。本文用回接感染健康鳜获得病毒原料，分离纯化了大量高纯度的ＩＳＫＮＶ病毒粒子，电镜下可见病毒粒子为二十面体，直径平均为１５０ｎｍ。抽提病毒核酸，对其基因组ＤＮＡ进行酶切分析，病毒基因组为双链ＤＮＡ分子，表现脊椎动物虹彩病毒基因组的特点即其胞嘧啶５’端高度甲基化。以限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ和ＰｓｔＩ酶切ＩＳＫＮＶ基因组ＤＮＡ，经电泳分离后，分别得到１、８、９、１８、２２条清晰的酶切片段，并根据酶切片段算得基因组的大小超过１０８．７ｋｂｐ。

葡萄无核基因SCAR标记的序列构成与酶切分析

利用葡萄无核基因的特异探针１８ｂｐ,通过ＰＣＲ扩增获得了与葡萄无核基因相连锁的ＳＣＡＲ标记约５９０ｂｐ,采用自动荧光ＤＮＡ测序仪对该片段的核苷酸组成进行双向测序,来自无核白的无核基因特异标记由５６９对核苷酸组成。该标记可以作为合成探针和设计特异引物进行ＰＣＲ扩增的基础,用于检测葡萄育种材料和无核品种的无核性。

呼吸缺陷型啤酒酵母菌株的重离子束辐照诱变筛选及其线粒体的限制性酶切分析

利用单核能为5.19MeV/u的22Ne5+辐照啤酒酵母菌株,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazoliumchloride,TTC)筛选培养基快速筛选呼吸缺陷型酵母菌株。通过一种新型而简便的限制性酶切分析手段,发现辐照后的呼吸缺陷型酵母菌株线粒体DNA发生明显变化,主要表现在与对照相比线粒体DNA出现大片段缺失,同时出现了少量新的条带,并在此基础上初步探讨离子束辐照诱变产生呼吸缺陷型酵母菌株的诱变机理。

马立克氏病病毒Rispens株和RL株B抗原基因的分离、克隆及初步酶切分析

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）血清Ⅰ型Ｒｉｓｐｅｎｓ株和ＲＬ株分别接种于原代鸡胚成纤维细胞，待出现８０％以上细胞病变后收获，经蛋白酶Ｋ消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀细胞和病毒的总ＤＮＡ（ｔｏｔａｌＤＮＡ）。以此为模板，根据已发表的Ｂ抗原基因核苷酸序列设计１对引物，通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增出１条约２．８５ｋｂ的特异性条带，斑点杂交证实其为Ｂ抗原基因。双酶切消化后，克隆到质粒ｐＵＣ１９中。酶切分析表明，在这２株病毒的Ｂ抗原基因上，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ的酶切位点分布与超强毒ＲＢＩＢ株、标准强毒ＧＡ株的完全相同。

四环素抗性基因PCR检测及酶切分析的实验与临床研究

采用PCR技术对551份泌尿生殖道分泌物标本进行四环素抗性基因（tetM）检测，并进行敏感性及特异性试验、应用Taq-1限制性内切酶对PCR产物进行酶解消化反应结果表明四环素抗性基因决定子的阳性检出率为36．84％（20／551），大多数PCR产物在酶解后可产生3个预期酶解片段（190bp、130hp及77hp），少数则缺如此3个酶解片段。研究结果提示，用PCR方法可敏感、快速、准确及大批量筛查tetM耐药基因，在tetM决定子内可能存在核苷酸序列上的差异。

一种蛙病毒的纯化和酶切分析

从患病虎纹蛙（Ｒａｎａ ｔｉｇｒｉｎａ ｒｕｇｕｌｏｓａ）蛾料中分离得到一种蛙病毒，感染鱼的 ＦＨＭ、ＣＯ、ＥＰＣ细胞，获得大量的病毒原料，分离纯化得到高纯度的病毒粒子，电镜下可见病毒粒子为二十面体，具囊膜，直径平均为 １２５ ｎｍ．抽提病毒核酸，对其基因组ＤＮＡ进行酶切分析，病毒基因组为双链ＤＮＡ分子，表现脊椎动物虹彩病毒基因组的特点即其胞晒唉 ５’端高度甲基化．以限制性内切酶 Ｘｂａ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ、ＫｐｎＩ和ＰｓｔＩ 酶切病毒基因组 ＤＮＡ，经电泳分离后，分别得到 １３、２５、６、１４、２２条清晰的酶切片段，并根据酶切片段算得基因组的大小超过 １００ ｋｂ．用 ＰＣＲ方法，得到这个病毒的主衣壳蛋白（ＭＣＰ）基因保守序列，与ＦＶ３相比，同源性达９８％．

产蛋下降综合症H_（91）病毒基因组DNA的酶切分析

从发病鸡群中分离的产蛋下降综合症病毒（ＥＤＳ＿（－７６））Ｈ＿（９１）株接种鹅胚收获的尿囊液，用氯化铯密度梯度离心等方法纯化了ＥＤＳ病毒。电镜下观察到病毒无囊膜，大小为７０～８５ｎｍ。从纯化的病毒悬液提取的核酸，经琼脂糖凝胶电泳只出现一条分子量为３４ｋｂ、背景清晰的核酸带。用６种限制性内切酶对其基因组ＤＮＡ进行了酶切分析，各种酶消化分别产生４，４，９，９，１１和３条片段。将此结果与ＥＤＳ标准株ＡＶ＿（－１２７）株基因组ＤＮＡ由相同的内切酶消化的结果进行比较发现，由ＨｉｎｄⅢ和ＳｍａⅠ消化２个病毒基因组ＤＮＡ产生的片段数及大小有些差异。

犬Ⅱ型腺病毒弱毒DNA的酶切分析及分子克隆

犬Ⅱ型腺病毒(CAV-2)是犬喉气管炎的病原。CAV-2感染通常只引起轻微的呼吸道疾病,但在其它病毒或细菌继发感染下可诱发较严重的肺炎、支气管炎、扁桃体炎和咽炎。此病毒与引起传染性犬肝炎(ICH)的CAV-1有密切的抗原相关性。CAV-2弱毒株可产生抗CAV-1的保护性免疫,是目前用于预防ICH和狐狸脑炎的有效疫苗。由于CAV-2本身致病不严重,致弱的CAV-2更为安全。因此,用弱毒株构建成基因工程载体,把犬细小病毒或犬及狐狸的其它病毒的主要抗原基因重组到其中的非必需区,可获得安全、有效和多用的病毒载体疫苗。为此,我们首先分析了CAV-2弱毒DNA的酶切图谱,并克隆了全病毒DNA的76.5％。

山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析

对山羊痘病毒贵州分离株(LD株和QL株)和参考株(Y株和B株),采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后,以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA,以3种核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切图谱分析。接种山羊痘病毒48 h^60 h后,Vero细胞呈现典型的细胞病变;病毒基因组提取样本的纯度在1.8~1.9之间,经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带;经3种内切酶酶切后,贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致,比参考弱毒株B株少3条~4条酶切片段。这为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究奠定了基础。

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的扩增及酶切分析

以从内蒙古区分离的 2株传染性喉气管炎病毒 (ILTV)株的DNA为模板 ,用设计好的 1对引物对这 2株毒株的 gB基因进行了PCR扩增 ,并对扩增产物分别用BglⅡ、PstⅠ、HindⅢ限制性内切酶酶切分析。结果表明 ,2个分离株均能特异性地扩增出该病毒 gB基因片段 ,片段大小完全一致 ,为 2 .6kb ;扩增产物的酶切图谱与参考株完全一致。

犬Ⅰ型腺病毒DNA的酶切分析及分子克隆

犬Ⅰ型腺病毒(CAV-1)弱毒用限制性内切酶EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,Pst Ⅰ,Sph Ⅰ和Hind Ⅲ消化分析后其图谱与强毒株相比没有差异。将弱毒DNA用Pst Ⅰ完全消化后以鸟枪法克隆到载体质粒pBluescrip'SK中,经用光生物素标记的CAV-1 DNA杂交筛选以及Pst Ⅰ分析重组质粒证明已将分子量为5.5,3.5,2.85,1.2,0.32和0.28Kb的CAV-1DNA片段克隆到质粒中。克隆到的这些片段将可考虑进一步研究作为探针检测犬及狐狸等野生动物的腺病毒感染。

双孢蘑菇mtDNA粗提物的酶切分析

发展了一种粗提双孢蘑菇mtDNA的方法 ,获得As2 796亲代及子代系列菌株的mtDNA粗提物 ,用HaeⅢ、CfoI、MspI、TaqI等内切酶进行酶切 。

不同分离株弓形虫hsp70基因体外扩增及其酶切分析

目的 不同分离株弓形虫hsp70基因的比较 ;运用限制性内切酶分析 (PRA)建立一种简单的虫株鉴定方法。 方法 采用PCR技术扩增hsp70基因 ;采用 3种限制性内切酶Bsp12 86Ⅰ、BstXⅠ、MboⅠ分别对该基因进行酶切比较。 结果 从 5种不同分离株的弓形虫基因组DNA中扩增出相似的约 2 0 2 2bp的完整HSP70基因阅读框序列 ;Bsp12 86Ⅰ酶切 5株弓形虫有 2组不同酶谱 ,而BstXⅠ、MboⅠ酶切的片段各株间没有差异。结论 5种不同分离株弓形虫的hsp70基因片段大小基本相同 ;但酶切图谱有差异 ,这可以为虫株鉴定和毒力研究提供参考。

产蛋下降综合征病毒DNA限制性酶切分析的研究

选用BamHI、KpnI、PstI、EcoRI、XbaI、HindⅢ等6种限制性内切酶对EDS76病毒内蒙古地区分离株穴N3、B4雪和参考株穴AV-127雪病毒基因组DNA进行酶切分析,均产生4,5,9,4,2和10条DNA片段,而且N3、B4株与参考株病毒基因组DNA之间的酶切图形、片段大小也十分相似,从分子水平上证实N3、B4株是EDS76病毒熏同时也说明限制性内切酶分析法是检测EDS76病毒的一种简便快速的方法。

RT-nestedPCR和限制性酶切分析用于HV的检测和基因分型

为建立检测肾综合征出血热 (HFRS)患者血清中汉坦病毒 (HV)基因的RT nestedPCR方法 ,并进一步进行限制性酶切分型 ,设计并合成互补于HVS基因片段的引物 ,对 78例HFRS患者血清进行RT nestedPCR检测 ,并对PCR产物进行酶切分析。结果显示 ,阳性率分别为 76 % (≤ 7天 )、6 7% (8～ 14天 )、43% (15～2 1天 )和 2 9% (>2 1天 )。 48例检测阳性患者PCR产物酶切分型 ,47例为Ⅰ型 ,1例为Ⅱ型。提示RT nestedPCR用于早期HFRS患者的HV基因检测 ,具有直接、敏感、特异等优点 。

上海四膜虫(Tetrahymena shanghaiensis)线粒体DNA的酶切分析

该文以六种限制性内切酶对上海四膜虫的mtDNA进行单酶完全酶切 ,EcoRⅠ、HindⅢ、HhaⅠ酶切均产生 4个片段 ,PstⅠ、HpaⅡ、HaeⅢ酶切分别产生 5、6、7个片段。不同的酶切片段大小及总和有一定的差异 ,酶切位点分布不均匀 ,片段长度多态性明显。与其它四膜虫mtDNA的同种酶切结果比较 ,有较大的差异。同其它方法如四膜虫大核rDNA限制性内切酶分析、同工酶分析及皮层细胞骨架组分分析结果一致 ,进一步证明上海四膜虫是梨形四膜虫复合种的一种。

EDSV分离株NE_4、GC_2 DNA的限制性酶切分析

用限制性内切酶BalⅠ、BalⅡ、BamHⅠ、CtaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅠ、SalⅠ、SmalⅠ、XbaⅠ及EcoR28Ⅰ＋BamHⅠ双酶消化对EDSV分离株NE4、GC2r的DNA进行了酶切分析。结果表明，二个分离株与标准株AV127DNA各酶切片段数及各片段的分子量（kb）未见差异，说明二者与AV127株属于同一基因型。

小眼高原鳅线粒体DNA的酶切分析

用4种限制性内切酶对小眼高原鳅进行了线粒体DNA的酶切分析,共检测出7个酶切位点,发现EcoRI一种酶切类型具有多态性。

托索湖花斑裸鲤线粒体DNA的酶切分析

用 4种限制性内切酶PstⅠ、PvuⅡ、HindⅢ、EcoRⅠ对托索湖花斑裸鲤进行了线粒体DNA的酶切分析 ,结果初步表明PstⅠ没有切点 ,PvuⅡ有 2个切点 ,EcoRⅠ有 3个切点 ,HindⅢ有 3个切点 。

新城疫病毒中国标准强毒株F_（48）E_9株F基因的酶切分析

含新城疫病毒Ｆ４８Ｅ９株Ｆ基因的重组质粒ｐＢＦＦ经单酶切，双酶切分析，结果表明，中国的标准强毒株Ｆ４８Ｅ５株的Ｆ基因与国外的一些强毒株相比有较大的差异，多出一个ＢａｍＨＩ酶切位点，一个ＳｅａＩ酶切位点，三个ｐｓｔＩ酶切位点，少了一个ｐｓｔＩ酶切位点。