大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术及其优化

建立和优化了大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术体系 (SADF)。分别用限制酶PstI、EcoRI和MseI酶切大麦基因组DNA ,再与各自相应的人工接头连接 ,使用带三个选择碱基的引物进行选择性扩增。结果表明 :采用分别优化建立的标准PCR扩增检测体系 ,六个识别碱基的PstI和EcoRI的SADF均能得到丰富稳定的带形 ,四个识别碱基的MseI不能得到明显谱带。SADF扩增产物片段大小范围为 :PstI一般在 2 0 0～ 2 0 0 0bp ,而EcoRI在 2 0 0～ 10 0 0bp ;两者在不同大麦品种中均能检测到多态性 ,可用于不同大麦品种的检测 ,但PstI得到的带型明显优于EcoRI,在大麦中得到的片段具有范围宽、分布均匀、易于观察、多态性高等特点。

红花cDNA相关序列扩增多态性的扩增体系优化

目的:建立一种适合以红花cDNA为模板进行相关序列扩增多态性(SRAP)扩增的体系,筛选最佳的SRAP-PCR反应条件。方法:提取红花RNA并反转录成cDNA,以此为模板,使用正交设计表设计PCR反应中的3个重要因素Taq酶、三磷酸脱氧核苷(dNTPs)、引物的反应浓度。随后设计Mg2+的反应浓度以及模板含量,分别进行单因素试验。结果:本研究建立的红花cDNA-SRAP扩增条件为:25μL反应体系中含模板cDNA 20 ng,1×PCR缓冲液2.5 mmol/L,Mg2+2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.04 U/μL,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.2μmol/L。优化后扩增结果稳定性好,条带清晰,多态性好。结论:该体系为红花功能基因的研究奠定了基础。

稻瘟病抗性基因Pi25特异性CAPS标记的开发与验证(英文)

为在水稻育种中快速与高效利用稻瘟病抗性基因Pi25,本文利用该基因不同等位基因编码区序列差异开发了4套CAPS标记(CAP1/HincII、CAP3/BglII、CAP3/NdeI和CAP3/Hpy99I),并利用169份稻种资源、98个重组自交系(RIL)以及217个水稻转基因后代,对4套标记的准确性和选择效果进行了验证。结果表明,4套标记均能准确地检测Pi25/pi25座位。其中,标记CAP1/HincII和CAP3/Hpy99I特异性识别并酶切显性等位基因,而标记CAP3/BglII和CAP3/NdeI特异性识别并酶切隐性等位基因。利用稻瘟病菌株JS001-20接种RIL与转基因材料,抗性表现与标记检测的结果完全一致,表明该CAPS标记准确可靠。分析稻种资源后发现,Pi25基因频率较低(1.2%),说明该基因在我国水稻稻瘟病抗性育种中还没有被充分利用。本文的研究结果特别是开发的2对识别并酶切显性等位基因的CAPS标记可用于分子标记辅助选择,改良我国早籼稻的稻瘟病抗性。

大豆EST-SNP的挖掘、鉴定及其CAPS标记的开发

采用生物信息学方法将大豆EST序列联配到大豆基因组序列上,挖掘到大豆EST-SNP位点537个。对其靶向基因进行功能注释分析,发现他们主要参与亚细胞定位、蛋白质结合与催化以及代谢等与大豆重要农艺性状形成相关的生物过程。同时开发了简便易行的SNP检测方法,利用EMBOSS软件筛选导致酶切位点改变的EST-SNP,分别以大豆绥农14、合丰25、Acher、Evans、Peking、PI209332、固新野生大豆、科丰1号、南农1138-2的DNA及其混合的DNA为模板,设计引物进行PCR扩增,发现44个PCR产物中有36个测序峰图在预期的EST-SNP位点表现出多态性。酶切分析发现26个PCR产物具有酶切多态性,可以作为CAPS标记。结果表明该EST-SNP挖掘体系及其CAPS标记转化系统具有高效率、低成本等优点,有利于促进大豆的遗传育种研究。

基于基因重测序信息的大豆基因靶向CAPS标记开发

为了开发大豆基因靶向的功能分子标记,本研究采用生物信息学方法分析了大豆基因重测序数据,筛选出酶切位点突变的SNP位点,设计PCR引物163对,选用东北地区主栽品种绥农14的DNA为模板进行PCR扩增,其中139对引物获得大小为400～1200bp的特异片段。以大豆绥农14、合丰25、Acher、Evans、Peking、PI209332、固新野生大豆、科丰1号和南农1138-2的DNA为模板,采用筛选的139对引物进行PCR扩增,对扩增产物进行酶切分析,发现73对引物的PCR产物具有酶切多态性,开发出CAPS标记73个。通过功能注释分析发现,这73个CAPS标记靶向的基因主要参与细胞内亚细胞定位过程、蛋白质的结合与催化以及代谢过程等,与大豆重要农艺性状的形成相关,可以用于大豆品种的鉴定和分子系统进化的研究。

烟粉虱Q与B隐种mtCOI基因的遗传变异及其对利用CAPS标记进行隐种鉴别的影响

【目的】为了评估Vsp I,Sty I和Stu I为基础的线粒体细胞色素氧化酶I基因(mt COI)酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)标记方法鉴别烟粉虱Q与B隐种的有效性。【方法】本研究对国内外烟粉虱种群的mt COI基因进行了测序并鉴定了其隐种;在对464个Q隐种、98个B隐种mt COI序列分析的基础上,利用Vsp I,Sty I和Stu I对Q与B隐种分别进行了CAPS标记验证。检索并比对了Gen Bank中烟粉虱Q与B隐种mt COI序列中Vsp I,Sty I和Stu I酶切位点分布情况。【结果】对国内外烟粉虱种群研究发现,以Vsp I为基础的CAPS标记方法能够有效鉴别实验中的Q与B隐种;利用Stu I或Sty I的CAPS标记方法无法有效鉴别Q与B隐种。对Gen Bank中烟粉虱Q与B隐种mt COI序列比对发现,利用Vsp I,Sty I和Stu I为基础的CAPS标记方法不能有效鉴别Q与B隐种。【结论】以Vsp I,Sty I和Stu I为基础的CAPS标记方法鉴别Q与B隐种方面均有一定的局限性。

多花黑麦草抗病基因类似物的克隆及CAPS标记

多花黑麦草具有适应性强、生物产量高和品质好等优点,为我国南方及其他温带地区重要的牧草。本研究利用目前已克隆出的抗病基因(R基因)所编码的蛋白质结构上所具有的共同氨基酸基序NBS-LRR设计寡核苷酸简并引物,对多花黑麦草基因组进行抗病基因类似物(RGA)克隆。从克隆中筛选出具代表性的RGA克隆115个,设计RGA-STS引物113对。利用细胞质雄性不育(CMS)F1群体对RGA-STS引物进行筛选,并采用限制性内切酶酶切扩增多态序列(CAPS)法进行抗病类似物的分子标记,共检测到22对RGA-STS引物的扩增产物具多态性,22个RGA-CAPS标记均被标记于多花黑麦草遗传连锁图中。结果还表明RGA在多花黑麦草遗传连锁图中分布范围较广,并具有簇状分布特性。

M342抗除草剂基因CAPS标记的开发与应用

M342是利用EMS诱变定向选育获得的甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂新种质。通过M342抗性基因与敏感型油菜的ALS基因序列分析结果表明,M342的BnALS3基因存在1处SNP突变,导致编码的蛋白质第556位色氨酸突变为亮氨酸,该突变导致基因序列对BsrD I内切酶消化的差异。为此设计了8条引物,从中筛选到引物对SU54F/SU58R在不同油菜品种中可以特异性扩增出目的片段,该片段经BsrD I酶切分型正确,从而开发了检测M342中抗性基因BnALS3R的CAPS标记。运用该标记对除草剂敏感型油菜、纯合抗性油菜及杂合抗性油菜BnALS3的基因型进行验证,并应用该标记对F_2、BC_1分离群体进行检测。结果表明,该标记验证的基因型结果与测序结果一致。F_2分离群体有Als3Als3、Als3als3、als3als3 3种基因型,BC_1分离群体有Als3als3、als3als3 2种基因型,与表型鉴定结果一致,遵循单基因遗传分离规律,表明该标记可以应用于抗性基因的检测。CAPS标记的获得为抗除草剂油菜的分子标记辅助选择育种奠定了基础。

水稻Wx基因的遗传多态性及其与主要米质指标的相关性分析

利用RM190和484/W2R-ACCⅠ标记分析了50个水稻非糯品种的Wx基因的等位性变异。其中,RM190揭示出7种(CT)n纯合变异类型和1种杂合类型,分别为(CT)20、(CT)19、(CT)18、(CT)17、(CT)14、(CT)11、(CT)10和(CT)11/(CT)18,并以(CT)11和(CT)18两种类型为主;484/W2R-ACCⅠ共揭示出2种纯合类型和1种杂合类型,分别为G/G型、T/T型及G/T型;(CT)11大多为G/G型,(CT)18大多为T/T型,这两个标记可将供试材料划分为10种等位基因变异类型。进一步分析表明,RM190揭示的Wx基因多态性可以解释直链淀粉含量变异的59.3%;484/W2R-ACCⅠ揭示的Wx基因多态性可以分别解释直链淀粉含量及胶稠度变异的56.1%和24.6%;而两标记共同可解释直链淀粉含量变异的72.4%。还对这两个标记在育种实践中的应用前景进行了探讨。

植物SNP数据库及转化CAPS的方法

单核苷酸多态性(SNP)在植物基因组中广泛存在,基于SNP的分子标记也正越来越广泛地应用到植物基因定位、图位克隆及分子标记辅助育种等方面。模式植物拟南芥和水稻的全基因组序列测定已经完成,拟南芥有两种生态型完成了全序列测定,水稻有两个品种完成了全序列测定。许多植物有来自不同品种或不同组织器官或生长发育阶段的大量的EST序列。这些序列是植物SNP开发的重要资源。利用生物信息学手段对全基因组序列或EST序列进行分析已经形成了许多SNP位点数据库,这些数据库的建立为基于SNP的基因功能研究及分子标记开发提供了宝贵的资源。本文对植物SNP位点开发涉及的数据库资源及已经形成的SNP位点数据库进行了总结,并讨论了将SNP位点转化成CAPS或dCAPS标记的方法和相应的工具软件。

格尔德霉素(GDA)能导致小麦基因组DNA多态性和甲基化修饰增加

刚露白的普通小麦(Triticum aestivum L.)种子用150μmol/L格尔德霉素溶液处理后,小麦根的生长受到抑制。随机扩增多态性DNA标记技术和双限制性内切酶酶切-随机扩增法检测显示,小麦根端分生细胞基因组DNA的多态性和甲基化比例均增加。本研究从分子生物学和表观遗传学水平探讨了格尔德霉素抑制小麦生长的机制。

通过分子标记辅助选择培育优良食味水稻新品种

为了培育食味品质优良、综合丰产性好的粳稻新品种,以高产粳稻品种武香粳14作母本,具有暗胚乳突变基因的优质粳稻品种关东194作父本配制杂交组合。利用与暗胚乳突变基因Wx-mq直接相关的单核苷酸差异,设计合成了CAPS标记,该标记能区分含或不含Wx-mq基因的纯合基因型和杂合基因型。利用该标记对武香粳14/关东194衍生的F5、F6株系进行辅助选择,筛选到含Wx-mq基因的纯合基因型,成熟后对胚乳淀粉性质的调查结果与分子检测结果完全一致,分子标记辅助选择效果达100%。最终将关东194的暗胚乳突变基因Wx-mq与高产基因聚合于一体,育成含有暗胚乳突变基因Wx-mq的优良食味粳稻新品种南粳46。

通过分子标记辅助选择培育优良食味水稻新品种南粳46(英文)

为培育食味品质优良、综合丰产性好的粳稻新品种,本研究以高产粳稻品种武香粳 14 作母本,以食味品质优良粳稻品种关东 194(含有控制低直链淀粉含量和暗胚乳的突变基因 Wx-mq)作父本配制杂交组合。通过比较 Wx-mq 与其位于第 6 染色体上的等位基因 Wx-b,Wx-a,wx 的 DNA 序列,发现 Wx-mq 基因的外显子 4 和外显子 5 上存在两个碱基突变,外显子 4 上的 G-A 突变产生了 NIaⅢ的酶切位点,并设计合成了能区分含或不含 Wx-mq 纯合基因型和杂合基因型的 CAPS 标记。利用该标记对武香粳 14/ 关东 194 衍生的 F5、F6株系进行辅助选择,筛选含 Wx-mq 纯合基因型的单株。成熟后对胚乳淀粉性质的调查结果与分子检测结果完全一致,分子标记辅助选择效果达 100%。这样我们就成功培育了食味品质优良、综合丰产性好的粳稻新品种南粳 46。

番茄品种Mi基因对根结线虫抗性的检测

采用酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS）方法对国内市场上的26个番茄So-lanum lycopersicum品种进行Mi基因检测.结果表明,特璐丝、红丽、TRS-401、仙客1号和仙客5号5个品种含有纯合体Mi基因,其余品种均不含Mi基因.进一步用南方根结线虫Meloidogyne incognita和象耳豆根结线虫M.enter-olobii对这26个品种进行接种试验,计算根结率和根结指数.结果发现,南方根结线虫和象耳豆根结线虫侵染不含Mi基因的21个番茄品种的根结率为100%,根结指数为100;而含Mi基因的5个番茄品种对南方根结线虫的根结率为1%~5%,根结指数为0~4,而对象耳豆根结线虫的根结率为26.7%~45.6%,根结指数为56~64.表明含Mi基因的番茄高抗南方根结线虫,但对象耳豆根结线虫感病或比较感病.

大豆耐盐相关基因GmNcl1功能标记的开发及验证

土壤盐渍化严重影响大豆生产,因而鉴定大豆耐盐种质的分子标记对大豆耐盐新品种的培育具有重要意义。本研究分析了大豆耐盐相关基因Gm Ncl1等位变异位点的限制性酶切位点,通过酶切PCR产物,琼脂糖凝胶电泳和酶切片段分析,开发建立了分子标记CAPS/Xba I。利用该标记对10份不同耐盐大豆种质进行酶切分型鉴定,然后通过测序试验进行验证。结果表明,用所开发的共显性标记CAPS/Xba I对10份大豆种质进行耐盐性鉴定,鉴定结果与依据表型进行鉴定的结果一致。由此可见,CAPS/Xba I可用于大豆品种的耐盐性鉴定。

基于S-SAP标记技术的柑橘芽变新品系青瓯柑的鉴别

青瓯柑是在普通瓯柑上新发现的一个疑似芽变品系,其与普通瓯柑和无籽瓯柑的差异为在采后贮藏3～4个月内青瓯柑果实外果皮仍可保持显著绿色。为进一步确认青瓯柑与普通瓯柑和无籽瓯柑的亲缘关系,基于新建立的瓯柑EcoRⅠ单酶切S-SAP标记技术体系,采用280个选扩引物组合,对现有的全部3种瓯柑（青瓯柑、普通瓯柑和无籽瓯柑）进行S-SAP标记片段筛选,并从C12（5′-TTAATCGCCTTGCAGCACAA-3′）和EAT（5′-GACTGCGTACCAATTCAT-3′）选扩增产物后进行分析。结果表明：获得1条长约260bp的青瓯柑特异的S-SAP标记片段;青瓯柑属于普通瓯柑芽变,获得的SSAP特异标记技术方法可为青瓯柑品种的认定、种苗鉴别及新品种推广提供技术支撑。

DNA分子标记概述

标记是人类生产和社会实践过程中籍以进行有效识别的标记物。遗传标记(geneticmarkers)则是用于区别不同物种、不同群体、不同基因型个体,并且能稳定遗传,具备足够变异性的一类标记。在生物学研究工作中,遗传标记是重要的工具,是用于观察。

柑橘CAPS标记和AS-PCR引物的开发

以从GenBank中下载的93 955条甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]EST序列为源序列,利用QualitySNP软件包从中挖掘出1 521个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)候选位点。进一步利用酶切位点查找软件WatCut进行分析,发现其中125个SNP为酶切扩增多态性序列(cleavedamplified polymorphic sequences,CAPS)位点。随机挑选40个CAPS候选位点设计引物,对12个含多种类型的柑橘品种进行分型,以此验证各标记的有效性。同时,还挑选了25个经生物信息学预测可导致其编码蛋白氨基酸序列改变的SNP位点,分别设计出一组等位基因特异PCR(allele specific PCR,AS-PCR)引物,以6个不同类型柑橘品种的DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测,筛选多态性引物。结果显示,40个CAPS候选位点中有26个位点具有酶切扩增多态性,且分型结果稳定,可作为CAPS标记。此外,还筛选获得15组在不同柑橘品种间检测到多态性的AS-PCR引物,重复性好,可有效用于柑橘品种的SNP分型。

葡萄SNP标记的CAPS和TSP分析

为了建立起葡萄SNP标记分析的一般方法和探索EST-SNP标记在葡萄中的应用,对前期开发的葡萄EST-SNP位点进行了筛选,设计了28对CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences,酶切扩增多态性序列)标记引物和22对TSP(Temperature-switch PCR,温度转变PCR)标记引物,并在31份葡萄材料中进行了分析,其中20对CAPS引物和10对TSP引物电泳条带较清晰,多态性较好。基因分型统计显示:所有的SNP位点均含有2个等位基因,平均多态性信息含量(PIC)为0.336,平均Shannon’s信息指数为0.511。基因分型和葡萄材料聚类结果均显示这两种方法所获结果提供的信息量大且结果可靠。本方法简便、成本低,可作为SNP分型有效方法用于葡萄品种鉴定、基因分型和遗传多样性分析等。