GoldenBraid酶切连接反应体系的优化

旨在获得更为高效稳定的GoldenBraid(GB)酶切连接组装反应体系。通过优化GB反应中酶切时间、缓冲体系、限制性内切酶和底物配伍来提高有效克隆的效率,确定最佳反应体系。结果显示,4 min酶切时间,1μL FastDigest Buffer(10×)缓冲体系,1 mmol/L ATP,0.5μL FastDigest Esp3I或FastDigest Eco31I,元件供体载体与受体载体的摩尔比3∶1时,有效克隆比例接近99%,是优化前(BsmBI 8%、BsaI 23%)的4倍以上,此时酶切连接效率接近100%。与原始方案相比,通过体系的优化,可以在更少内切酶用量(原方案为1μL)的情况下,显著提高有效克隆比例,表明本方法能提高GB系统的酶切连接效率和实用性。

应用于小鼠早期胚胎细胞的ChIP-seq体系中基因组水解酶的筛选

在过去的十几年中,染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-seq)成为了分析表观基因组和鉴定DNA相关蛋白重要结合位点的主要技术。然而,ChIP-seq技术目前仍存在一些技术难点。其中一个重要限制是ChIP-seq需要大量的起始材料,需要至少数百万个细胞才能启动,然而实验中有两个关键步骤往往会造成所使用的样本丢失,即染色质制备和免疫沉淀。本实验通过从染色体制备入手,通过选择两种不同核酸水解酶DNase和MNase,设计不同实验组验证最佳酶切浓度,以优化ChIP-seq体系。结果证明0.1U/μL的MNase为本实验中ChIP-seq最佳酶切浓度。结果为ChIP-seq体系的优化提供了参考,对ChIP-seq技术在小鼠早期胚胎细胞中的应用以及发展有一定的积极意义。

利用CRISPR-Cas9技术敲除MAS1基因的质粒构建与酶切方案优化的研究

CRISPR-CAS9技术是新一代基因编辑技术,可简便快捷地对哺乳动物细胞进行指定基因的敲除,实现沉默外源基因表达的目的。但传统的CRISPR-CAS9技术提供的酶切方案没有特异性,致使酶切效率不稳定,影响胶回收率以及后续实验。本实验通过改变酶切体系大小,以及酶切反应时间,继而通过胶回收率及测序检测的方法验证最佳酶切条件,最后通过荧光定量PCR和Western blotting实验检测目的基因的表达量,确认是否成功敲除目的基因。研究结果说明:BbsⅠ酶与px459质粒比值为1μL:500 ng,酶切体系为50μL,酶切时间为45 min时,酶切效果最佳、胶回收率最高,且此时目的基因在细胞内的表达量为0,确定该实验条件下目的基因被成功敲除。