栽培高粱叶绿体DNA的酶切片段分析

实验选取了具优良性状的高粱 ( Sorghum bicolor) 4品种、两细胞质雄性不育系 ,采用改进的高盐低 p H值法对其叶绿体 DNA进行提取、纯化、限制性内切酶酶切分析 .结果表明 :改进的高盐低 p H值法无论在 DNA的得率及质量上都有一定的提高 ,足以满足 RFL P或其他酶切方法的需要 ;高粱栽培品种间的叶绿体 DNA变异很少 ,反映了各族间极其相近的亲缘关系 ;在可育胞质品种与胞质雄性不育系的叶绿体 DN A之间明显存在两类酶切式样的差异 ,在雄性不育系的叶绿体 DNA中存在一可能的点突变和另一可能的大断缺失 ,该高粱叶绿体 DNA的变异是否参与雄性不育性的形成尚需进一步的实验加以证实 .

云贵两省三地带绦虫的分子鉴定——核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析

目的用PCR-RFLP方法对rDNA-ITS1片段进行分析,以进一步明确云贵地区是否存在牛带绦虫亚洲亚种,并建立一种快速鉴定方法。方法取贵州都匀株(DY)、贵州从江株(CJ)、云南大理株(DL)带绦虫及台湾株(TW)成虫标本,剪取孕节,抽提DNA,PCR扩增rDNA-ITS1片段,分别用4种限制性内切酶MspI、CfoI、AluI、RsaI对扩增片段作酶切分析。结果PCR产物经AluI、RsaI酶切后,TW、DL、DY和CJ株RFLP图谱一致;经MspI、CfoI酶切后,TW、DL和DY株RFLP图谱一致,CJ株显著不同。结论1)DL和DY株与TW株同属牛带绦虫亚洲亚种;而CJ株是传统牛带绦虫;2)rDNA-ITS1的PCR-RFLP分析方法简便,可以用于带绦虫的分类学研究。

用于微生物多样性分析的棉田土壤总DNA的提取

目的:探讨适用于微生物多样性研究的棉田土壤微生物总DNA提取方法。方法:采用4种方法提取不同连作和轮作处理的棉田土壤微生物总DNA,比较其纯度、产率、片段大小,并应用ARDRA技术验证其质量。结果:其中3种方法均可获得23kb的DNA片段,但不同方法提取的DNA的产率和纯度上有明显差异。改良CTAB-SDS法提取的DNA完整性好,得率为24.20μg.g-1干土,纯化后A260/A280和A260/A230为分别为1.80和1.70,纯化回收率可达70.1%,完全适用于后续的PCR分析。结论:采用该法提取棉田土壤总DNA简便而高效。对该法提取获得的棉田土壤微生物总DNA进行ARDRA和DGGE分析,所得图谱能较全面地反映不同处理间微生物多样性及群落结构的差别,为不同栽培体系下棉田土壤微生物的分子生态学研究提供了基础。

限制性酶切片段长度多态性分析用于乙型流行性感冒病毒巴拿马株与维多利亚株的快速鉴定

利用限制性酶切片段长度多态性分析 (RFLP)鉴别乙型流行性感冒 (流感 )病毒的巴拿马株与维多利亚株 ,对乙型流感病毒血凝素 (HA)基因采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增后 ,用HindⅢ做酶切反应并进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示 :乙型流感病毒维多利亚株或巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增 ,且与甲1与甲3 型流感病毒无交叉反应。该片段经HindⅢ酶切后 ,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现 6 0 3bp与 2 4 2bp的 2个片段 ,而乙型流感病毒维多利亚株在该片段无 HindⅢ酶切位点 ,仍呈 872bp的一个片段。表明该方法不仅可作为常规血清学方法的补充 ,对乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株作出正确判定 。

湖南岳阳洞庭湖3个样点的表层水体细菌多样性研究

从湖南岳阳南湖、同联药业和城陵矶等3个洞庭湖样点采集表层水样,分别编号为NH、TL和CL.在进行水样元素成分分析的同时,采用扩增rDNA限制性酶切片段分析(Amplifed Ribosomal DNA Restriction Analysis,ARDRA),对上述水样中的细菌多样性进行研究.3个样品共挑出234个克隆子进行酶切,得到135个可操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTUs),并对其中14个优势克隆子进行测序.系统发育分析显示洞庭湖岳阳段水样中微生物群落具有丰富的多样性,其中:NH样品中的优势菌是Flavobacteriumsp和Pseudomonas sp,分别占22.4%和11.2%;CL样品中的优势菌为Catellibacterium和Acinetobacter,分别占9.6%和8.2%;而样品TL中的优势菌则为属于β-Proteobacteria的一个新菌株,占11.1%.

Bcl-2基因多态性与乳腺癌临床生物学指标的关系

目的：探讨凋亡基因Bcl-2启动子区C（-938）A单核苷酸多态性（snigle nucleotide polymorphism,SNP）与河北省乳腺癌患者临床生物学指标的关系。方法：采用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）方法检测113例乳腺癌患者Bcl-2基因C（-938）A SNP的3个基因型（即AA、AC和CC）,并与临床生物学指标相关联,比较各组间基因型频率的分布情况。结果：按腋淋巴结转移个数进行分层分析,AA型和AC＋CC型在无转移、1~3个转移、≥4个转移组中分别占26.8%、47.8%、52.6%和73.2%、52.2%、47.4%,两组比较差异有统计学意义（χ2=6.337,P=0.042）;与AC＋CC型相比,AA型在≥4个转移组OR值为3.041（95%CI：1.072~8.626）。在组织学分级中,AA型和AC＋CC型在Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级中分别占30.9%、57.9%和69.1%、42.1%,两组基因型分布差异有统计学意义（χ2=5.055,P=0.025）;与AC＋CC型相比,AA型在肿瘤分化Ⅲ级组中OR值为3.082（95%CI：1.122~8.465）。按雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）和C-erbB2蛋白表达水平进行分层分析,发现AA型和AC＋CC型的上述指标分布差异无统计学意义（χ2=3.005,χ2=1.504,χ2=1.163;P〉0.05）。结论：乳腺癌患者Bcl-2基因C（-938）A SNP的AA基因型与其腋淋巴结转移率较高和肿瘤组织分化较差相关。

PCR-RFLP和PCR-SSCP技术在肠杆菌科食源性感染致病菌鉴定中的应用

目的探讨运用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌快速鉴定方法的可行性。方法选取肠杆菌科食源性感染14种常见致病菌的23 S rRNA基因作为鉴别靶基因,采用通用引物PCR(UP-PCR)进行扩增,并对PCR产物的酶切片段进行限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP)。结果针对23S rRNA基因片段的Hpa II酶切产物的RFLP分析表明,不同种属的致病菌表现出相似的RFLP图谱。SSCP分析显示,14种肠杆菌科常见致病菌SSCP图谱变异性很大,有利于进行细菌鉴定。结论运用PCR-SSCP技术可进行肠杆菌科食源性感染致病菌的快速鉴定。

PCR-RFLP法检测生殖道沙眼衣原体感染

目的 建立检测沙眼衣原体的聚合酶链反应 -限制性内切酶切片段长度多态性分析 (PCR -RFLP)方法。方法 在利用PCR扩增沙眼衣原体的基础上 ,引入RFLP方法 ,并与美国ABI公司的金标免疫层析法试剂盒和镜检包涵体法比较。结果 共检测 40例临床确诊病人 ,镜检包涵体法有 15例 (37.5 % )阳性 ,金标免疫层析法有 2 3例 (5 7.5 % )阳性 ,而PCR-RFLP法有 2 9例 (70 .3 % )阳性 ,各组间有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 我们认为PCR -RFLP法优于镜检包涵体法。

PCR-RFLP鉴别假高粱和丝克高粱

本文利用PCR特异引物扩增rDNA-18S-26S基因,对PCR产物进行纯化、克隆和测序;分析假高粱与丝克高粱rDNA-18S-26S的酶切图谱,选择合适的限制性内切酶对两者PCR产物进行特异性切割,按照酶切片段的长度来区分两个近似种。被AflⅢ酶切后,假高粱被切割为674bp、174bp两个片段,而丝克高粱被切割成181bp、174bp、495bp、669bp4个片段。为建立PCR-RFLP分子鉴定方法有效地区分假高粱与丝克高粱这两个种提供依据。

广西巴马地区长寿老人 ApoE 基因多态性与认知功能的关系

目的:研究广西巴马地区长寿老人载脂蛋白E(ApoE)基因多态性的分布及其与认知功能改变的关系。方法:采用简易精神状态量表(MMSE)对112例90岁以上广西巴马地区长寿老人进行认知功能检查,并用限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法进行ApoE 基因分型。根据MMSE 得分将研究对象分为认知功能正常组和认知功能障碍组.比较两组人群的基因型、基因频率的分布特征。结果:巴马长寿老人中发生认知功能障碍者占14.29%。长寿老人中ApoEε3/3基因型分布的百分比最大,其次是ε2/3,而ε4/4最少。ApoE 各基因型和等位基因频率认知功能正常组和认知功能障碍组相比较,ε4等位基因频率认知障碍组明显高于认知正常组(P<0.01),ε4基因携带者认知功能障碍发生率明显高于其他基因携带者。结论:巴马地区长寿人群中,ApoEε3/ 3为最常见的基因型,而ε4/4最少;ApoE 基因多态性与巴马长寿老人认知功能改变有关联;ApoEε4基因仍然是长寿老人认知功能障碍发病的危险因子,较低的ApoEε4等位基因频率可能是巴马地区长寿老人认知功能保存较好的原因之一。

河南IBV肾变型地方分离株的分型研究

在气管环上进行交叉中和试验,结果显示河南分离的肾变型宜毒株与除T株以外的其余标准血清型毒株(M41、Holte、Arka、Conn、Gray)均有不同程度的交叉,但与Ark株相关性最大,为25%。将除Holte株以外的5株标准株和宜株的0.6kb扩增产物,用三种限制性内切酶AluⅠ、TaqⅠ和AfaⅠ进行酶切,RFLP分析可分为三种模式,宜株与Ark株、Gray株、CoNn株属同一模式,AluⅠ和AfaⅠ酶切阳性而TaqⅠ酶切阴性。另AluⅠ、TaqⅠ、AfaⅠ酶切均阳性的M41模式和TaqⅠ、AfaⅠ酶切阳性而AluⅠ酶切阴性的T株模式。将地方株宜株的0.6kb扩增片段进行测序并与标准株Ark株、Gray株、Conn株、Holte株和M41株的相应序列进行分析比较,核苷酸、氨基酸同源性的分析显示,宜毒株与同一酶切类型的Ark＿1529＿29株同源性最高,核苷酸同源性为93%,氨基酸同源性为91.6%。推测宜株可能是Ark血清型毒株的变异株。宜株与Ark株在血清学分型与基因分型上的一致性,表明这两种分型方法之间有一定的内在联系。

一种基于PCR分析多样性的小鼠肠道微生物宏基因组提取方法

目的建立一种基于PCR分析分子多样性的小鼠肠道菌群宏基因组提取方法。方法比较、综合国内外小鼠肠道菌群宏基因组的提取方法后建立一种新方法,小鼠肠道内容物经丙酮洗涤,差速离心,溶菌酶、SDS裂解,CTAB处理,酚/氯仿抽提后可得到高质量的DNA,通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、细菌通用引物PCR和扩增核糖体限制性酶切片段分析(ARDRA)等检测该方法的实用性。结果该方法获得的小鼠肠道菌群宏基因组DNA大小在23 kb左右,A260/A280在1.8～2.0,经细菌通用引物PCR后能得到适用于ARDRA的目的产物。结论该方法经济适用性较强,具备一定的应用价值。

大庆油田油藏采出水的细菌群落结构

采用ARDRA(扩增性rDNA限制性酶切片段多态性分析)技术对大庆油田聚驱、水驱和过渡带3种油藏采出水中的细菌群落的基因组总DNA的16SrDNA克隆文库进行分析,研究了细菌群落结构.结果表明:随机挑取的596个阳性克隆可分为85个操作分类单元(OTUs),其中聚驱、水驱和过渡带文库分别含有28、41和33个.通过对优势OTUs测序,并与GenBank进行序列比对,发现油藏采出水中的优势菌群为不动杆菌属、弓形杆菌属、厚壁菌门、假单胞菌属和硫磺单胞菌属.聚驱样品中细菌群落组成最简单,优势菌群为不动杆菌属,占库容的85%,假单胞菌属占7%;水驱样品中的优势菌群也是不动杆菌属,占库容的62%,假单胞菌属和硫磺单胞菌属各占20%和6%;过渡带文库的细菌群落的优势菌群为弓形杆菌属,占库容的50%,不动杆菌属和厚壁菌门各占19%和18%.

三七根腐病株根际土壤真菌群落组成与碳源利用特征研究

根腐病是药用植物三七Panax notoginseng的多发性病害,而土壤真菌群落组成与根腐病的发生存在一定的联系。利用末端限制性酶切片段长度多态性分析和Biolog技术研究了云南文山三七种植园健康和发病三七植株根际土壤真菌群落结构和碳源利用特征,结果表明健康和发病植株的根际土壤真菌多样性和代谢活性差异不显著,但是真菌群落组成存在差异。健康和发病植株根际土壤都以小茎点霉Phoma exigua及镰孢菌属Fusarium真菌为主要种群,而健康植株根际土壤中火丝菌属Pyronema和被孢霉属Mortierella等真菌类群的相对丰度显著高于发病植株根际土壤,尖孢镰孢菌F.ox‐ysporum和刺座霉属的Volutella colletotrichoides的相对丰度则显著低于发病植株。

搅拌槽反应器中中度嗜热浸矿菌预处理含砷金矿

从多个矿坑、煤堆废水中富集中度嗜热浸矿菌,并在搅拌反应器中经过两年的长期驯化,获得能耐受高矿浆浓度和具有抗砷性的浸矿混合菌.对浸矿混合菌进行耐高矿浆浓度的驯化,保持矿浆浓度为200g/L,改变两种金矿的配比,提高驯化体系中砷含量,进行耐砷性驯化.用驯化的浸矿混合菌对难处理金矿进行生物氧化预处理,矿浆浓度为200g/L,砷含量为8g/L,14d时菌体浓度最大,达2×109mL-1,22d时砷浸出率为59.93%.采用限制性酶切片段长度多态性分析对浸矿14和22d时的微生物多样性进行分析,发现存在Sulfobacillus sp.,Acidithiobacillus caldus,Ferroplasma the rmophilum和Pseudomonas sp..

吉林省乙型肝炎病毒基因型分型及临床研究

目的了解吉林省乙型肝炎病毒(HBV)的基因型流行及分布情况,探讨HBV基因型与其预防治疗的临床意义。方法采用多对型特异性引物套式聚合酶链反应(nest-PCR)对吉林省194份HBV阳性血清进行分型,并研究HBV与预防和治疗的关系。结果在194例HBV血清阳性标本中,B型16例,C型172例,B、C混合型6例,未发现其它型别的病毒。结论在吉林省HBV的基因型主要为C型,B、C混合型也占了一定比例。C型与肝硬化和肝癌关系密切,混合型与慢性肝炎关系密切。

贵州省2004年分离到的脊髓灰质炎病毒分子生物学特征

目的研究贵州省2004年分离到的脊髓灰质炎(脊灰)病毒分子生物学特征。方法对贵州省2004年分离到的所有脊灰病毒,用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行了型内鉴定,并对型内鉴定异常株进行了VP1区的序列测定。结果贵州省在2004年急性弛缓性麻痹(AFP)病例及接触者、流动人口和健康儿童的粪便标本中,共有95例分离到脊灰病毒。其中Ⅰ型22例,Ⅱ型26例,Ⅲ型21例,混合型19例,脊灰病毒混合非脊灰肠道病毒7例。经用PCR-RFLP和ELISA方法进行型内鉴定,共有16株病毒与疫苗株病毒存在差异,其中3株脊灰病毒与疫苗株病毒在PCR-RFLP图谱上有差异[其中1株同时为双反应(DRV)],3株ELISA结果为DRV,11株ELISA结果为非疫苗类似株(NSL)。在这些型内鉴定异常株病毒中,Ⅰ型13株,Ⅱ型3株。对这16株脊灰病毒进行VP1区序列测定,发现9株Ⅰ型疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)和1株Ⅱ型VDPV。结论根据对贵州省2004年从95例AFP病例及接触者、流动人口、健康儿童分离的脊灰病毒的血清定型结果和型内鉴定结果及对13株Ⅰ型和8株Ⅱ型脊灰病毒VP1区核苷酸序列测定证实,脊灰减毒活疫苗病毒在人群的循环导致疫苗病毒神经毒力恢复突变。通过AFP病例监测系统及时发现了Ⅰ型VDPV的循环和Ⅱ型VDPV。对2004年下半年脊灰病毒基因特点的分析,提示贵州省已经阻断了Ⅰ型VDPV的循环。

用PCR/RFLP技术对福建省宁化林区鼠蜱类中斑点热群立克次体的检测

目的了解福建省宁化林区斑点热自然疫源地存在情况。方法用聚合酶链反应(PCR)对该林区鼠、蜱类中感染斑点热群立克次体(sFGR)进行扩增。用限制性酶切片段长度多态分析(RFLP)法对分离株 NH-97进行鉴定,并同已知的西伯利亚立克次体等国际标准株进行比较。结果从越原血蜱、金泽革蜱、微小牛蜱中扩增出 SFGR 特异的 DNA 片段,NH-97分离株的 PCR 产物经 PstI 和 RsaI 酶切后发现它们的酶切图谱与西伯利亚立克次体246国际标准株相同。从社鼠,黄胸鼠脏器中扩增出康氏立克次体 DNA 片段。由不同来源批次的越原血蜱中扩增出近缘于日本立克体 DNA 片段和相关序列提示:可能是斑点热群立克次体新成员。结论福建宁化林区除存在西伯利亚立克次体外,还可能存在康氏立克次体,日本立克次体等多种斑点热群立克次体的疫源地。