蜈蚣等5种动物类中药18SrRNA基因酶切鉴定的初步研究

目的 用基因酶切法鉴定蜈蚣等 5种动物类中药 ,为中药生物鉴定法的构建提供基本方法。方法 PCR法 (聚合酶链式反应 )与酶切。结果 限制性内切酶EcoRⅡ可以一次性鉴别出 5种动物中药。结论 EcoRⅡ是鉴定蜈蚣等 5种动物药1 8SrRNA基因最佳内切酶 ,酶切的基本步骤为 :基因片段的扩增、酶切、电泳检测 ,该方法可用于中药的品种鉴定 。

甜菜NADH-NR gDNA全长序列的克隆及酶切鉴定

为了研究甜菜NADH-NR gDNA的序列特征,从分子水平上为甜菜硝酸盐累积差异机理的研究做铺垫;利用二倍体甜菜品种‘甜研7号’,采用分步克隆方法,分别获得甜菜NADH-NR基因组DNA的3’端序列和5’端序列以及中间序列,再以3’端和5’端序列设计特异引物,克隆获得甜菜NADH-NR基因组DNA的全序列;结果表明,甜菜NADH-NR gDNA全长序列6346bp,经与先前获得的甜菜NADH-NR cDNA序列比对,甜菜NADH-NR gDNA含有3个内含子,4个外显子。内含子大小分别为197、1088、2343bp。甜菜NADH-NR gDNA的外显子序列与菠菜的同源性达到78%,但内含子序列在进化期间发生了较大分化,甜菜NADH-NR gDNA的内含子相对菠菜要大,两者也不处于同样的位点,甜菜NADH-NR gDNA的内含子靠近5'端较早出现,每个内含子大小均是菠菜的1.10～1.71倍。本研究首次从甜菜中克隆获得NADH-NR gDNA全长序列,揭示了其序列特征并将其与其他作物进行了比较分析,为进一步利用该基因开展甜菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。

鼠源巨噬细胞RAW264.7中TNF-α基因的克隆及酶切鉴定

TNF-α能诱导单核巨噬细胞系统的前体细胞分化,是机体非特异性免疫检测中指示性细胞因子。本研究根据Genbank NM-013693上登录的小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)序列对经过氨基多糖纳米微粒处理过的小鼠RAW264.7细胞进行RNA的提取,且RT-PCR扩增TNF-α基因。将此片段克隆到PUCm-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定、酶切鉴定分析验证,证实所克隆序列为TNF-α基因。序列分析表明,该基因与Genbank中发表序列的同源性达到100%。

农杆菌质粒DNA的间接酶切鉴定

采用常规手段提酶切鉴定法,与普通大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒提取农杆菌质粒酶切鉴定法(简称试剂盒法)和农杆菌质粒反导大肠杆菌间接酶切鉴定法(简称间接法)进行对比,发现本试验创新的试剂盒法和间接法可轻松做酶切鉴定,可为农杆菌质粒DNA提取经验不足者参考。

质粒提取与酶切鉴定实验教学感悟

生物化学与分子生物学实验教学涉及多种重要的分子生物学技术,对于临床医学和临床医学类专业学生的科研和工作具有重要意义。本文以质粒提取与酶切鉴定为主,就教学过程中发现的问题展开分析,探讨如何达到更好的教学效果、培养学生的科研思维。

通用引物检测脑炎患者脑脊液疱疹病毒DNA及其酶切鉴定

疱疹病毒（ＨＳＶ）引起的脑炎不经治疗死亡率高达７０％，若获早期诊断治疗，死亡率可降至（１９～２８）％〔１〕。临床迫切需要快速、特异、敏感的诊断方法。９０年代后，陆续有用ＰＣＲ对病毒性脑炎作病原诊断的报道，但用通用引物检测病人脑脊液（ＣＳＦ）中疱疹病毒...

通用引物检测畸胎标本疱疹病毒及其酶切鉴定

通用引物检测畸胎标本疱疹病毒及其酶切鉴定左丽卓礼梅董熙昌郭辉玉先天性畸形是严重影响儿童健康发育的重要疾患。疱疹病毒是重要的致畸因素，巨细胞病毒（ＣＭＶ）、１，２型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ１，２）和ＥＢＶ（ＥＢ病毒）都有致畸的报道。由于不易获得相应标本和实...

HPV 6b L1基因原核表达系统的构建及鉴定

克隆、构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)L1基因重组质粒,并进行表达和鉴定。用PCR方法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV6b型L1基因,构建重组克隆质粒pblue-HPV6bL1,测序分析其基因变异。将本地株HPV6b型L1基因酶切后连接到原核表达质粒pBAD,构建原核表达系统pBAD-HPV6bL1/Top10,酶切鉴定证明重组质粒的正确性。经L-Arobinose诱导后表达HPV6b型L1蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pBAD-HPV6bL1构建成功,诱导后能够表达L1融合蛋白。HPV6bL1重组质粒构建成功,并获得HPV6bL1蛋白,为该蛋白的功能及HPV的基因工程疫苗研究提供了物质基础。

人低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人HIF1α腺病毒表达载体,研究人低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用。方法采用分子克隆技术,从pcDNA3.1/V5-HisA-HIF1α质粒获得HIF1αcDNA,经pcDNA3.1(+)克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组穿梭质粒,含有HIF1αcDNA的表达盒通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-XViralDNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×109pfu/mL。结论成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α,为冠心病的基因治疗研究奠定基础。

MMP-9反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cDNA序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),先将扩增产物克隆至pGEM-T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,然后对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的MMP-9反义RNA表达质粒pcDNA3.1-MMP-9分别作PCR及双酶切(BamH和Hind)鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与反义MMP-9序列设计完全一致。结论成功构建了MMP-9反义RNA真核表达载体pcDNA3.1-MMP-9,为进一步研究MMP-9蛋白分子的生物学功能和以MMP-9为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。

c-myc靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的:设计构建重组体为转染肿瘤细胞,观察癌基因的沉默效果,为探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法:以c-myc为靶基因,以pEGFP-C1/U6质粒为载体,设计构建重组体,根据c-myc癌基因cDNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pEGFP-C1/U6中,转化DH5а菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。结果:经酶切鉴定筛出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建小干扰RNA重组体。

人骨保护素基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建人骨保护素(hOPG)基因的重组腺病毒载体并检测其转染能力。方法采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带hOPG基因的重组腺病毒AdEasy-PAdtrack-CMV-hOPG,将重组腺病毒AdhOPG对大鼠骨髓基质细胞(rMSCs) 进行感染。采用PCR方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度。结果酶切鉴定及PCR结果证明hOPG基因重组腺病毒载体成功, 病毒滴度可达2．5×108pfu／ml,具有很强感染能力,结论应用细菌内同源重组法,成功构建了含 hOPG重组腺病毒载体。

幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22,构建幽门螺杆菌omp22基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据。方法:利用PCR技术从Helicobacter pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA上扩增omp22基因,并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果:PCR方法扩增的omp22基因长度约为540 bp。经酶切鉴定,插入到表达载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为22 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%。结论:成功克隆并构建了omp22基因高效原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础。

含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒重组体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒。方法:将抗凋亡基因bcl-2片段从载体pcDNA3.1中切下,定向插入逆转录病毒载体PLNCX2中,酶切鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定表达bcl-2的细胞株。结果:双酶切鉴定,成功构建重组逆转录病毒载体;重组逆转录病毒转入包装细胞PT67,经G418筛选,形成了抗性克隆,并测得病毒滴度为3×1011cfu/L,提示构建的含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论:含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒载体构建成功。

高表达人cycli nG2基因的SGC-7901细胞克隆筛选和鉴定

应用脂质体基因转染技术建立稳定表达cyclin G2基因的胃癌克隆细胞,为深入研究cyclin G2在胃癌细胞周期调控的作用和机制提供理想的生物学模型。构建以新霉素基因作为筛选标志基因的包含人cyclin G2基因真核重组表达载体pIRES-G2,大量扩增纯化后经限制性内切酶BamH I/BstX I双酶切鉴定;利用阳离子脂质体介导的基因转染法将其和对照空载体pIRESneo转染人胃癌细胞SGC-7901,经G418选择性培养基筛选后有限稀释法连续克隆化,免疫细胞化学染色检测cyclin G2蛋白表达情况。酶切结果表明cyclin G2cDNA已成功插入pIRESneo的多克隆位点内;经G418筛选后在转染pIRES-G2和转染pIRESneo组均见多个细胞克隆出现,细胞化学染色证实pIRES-G2转染组cyclin G2蛋白的表达水平明显高于pIRESneo转染组;经过多次有限稀释获得稳定高表达cyclin G2的细胞克隆。应用脂质体转基因技术成功建立高表达cyclin G2基因的人胃癌细胞克隆。

DNMT1、DNMT3b siRNA重组质粒的构建及鉴定

目的:构建DNA甲基转移酶(DNMT1)、DNMT3b微干扰RNA(siRNA)重组质粒,并鉴定其正确性。方法:构建DNMT1siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒各4种,分别用BamHⅠ和PstⅠ酶切、测序、鉴定。结果:用BamHⅠ和PstⅠ进行双酶切后所有质粒均为阳性重组载体,每一种载体选择两个克隆进行测序鉴定,测序结果与插入的寡核苷酸的序列完全相符。结论:DNMT1 siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒正确,可用于后续实验。

视蛋白基因启动子的克隆和鉴定

目的 克隆出视蛋白基因启动子。方法 以小鼠全基因组为模板 ,用PCR法克隆出目的大小的片断。然后连接到T -载体上作酶切鉴定 ,最后测序。结果 酶切结果与预期相符 ,测序结果与公布序列完全一致。

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建与鉴定

利用λZAPExpress载体成功地构建了中国猪株旋毛虫分离株Trichinellaspiralis新生幼虫的cDNA文库 ,并对其重组噬菌体质粒pBK—CMV进行酶切鉴定 .结果表明 :所构建的cDNA文库容量为 1 92× 10 6,重组效率为 98 6 % ,所有的克隆片段都在 0 5— 2 0Kb之间 ,说明此cDNA文库几乎覆盖了全部mRNA .

含有马立克氏病病毒糖蛋白B基因重组质粒的构建及其鉴定

将马立克氏病病毒(MDV)GA 株基因文库中 BamH I I_3和 K_3克隆片段分别用 BamH I 加 Sal I 和 BamH I加 EcoR I 双酶切消化。含有编码 MDV 糖蛋白 B(gB)部分 DNA 的2.B kb、BamH I-Sal I 片段和1.1kb、BamH I-EcoR I 片段与 Sal I-EcoR I 消化的载体 pUR 222通过三聚体连接方式相连接。限制性核酸内切酶分析表明,重组质粒含有 MDV gB 基因,并且 MDV GA 株 gB 基因克隆在 EcoR I,Hind,Ⅲ,Xba I 和 Sal I 切点与 MDVRBIB 株相同。

基于CRISPR-Cas9的拟南芥基因编辑后代鉴定技术的优化

利用CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated nuclease 9)系统对植物进行定点编辑的技术已经日渐成熟,但对于被编辑植株后代的鉴定依旧费时费力,以拟南芥SDP1(Sugar-dependent 1)基因为编辑对象,优化编辑植株后代的鉴定方法。对SDP1基因序列进行分析表明,SDP1基因外显子上含有PAM(Protospacer adjacent motif)序列,且其上游合适的酶切位点有4个,选择第二外显子上含有最常见的SacⅠ酶切位点的20 bp序列作为基因敲除的靶位点,构建了CRISPR-SDP1-Cas9载体,实现对SDP1基因的定点编辑。对经过潮霉素筛选的T1株系DNA进行酶切鉴定和测序峰图分析,选出SacⅠ酶切为3条带的杂合编辑植株,随机挑选的71株T1植株中有24株发生了杂合编辑,编辑效率为16.9%。在48株T2转基因植株中有5株发生了纯合编辑,经测序编辑位点均为SacⅠ酶切位点上碱基插入。综上,选用待编辑基因上PAM序列附近合适的酶切位点作为编辑靶点,通过酶切和测序峰图分析来鉴定后代植株,相比于传统方法对后代植株提取DNA、PCR扩增靶位点、连接T载体后进行多次测序,此方法方便、快捷且经济实用,为CRISPR-Cas9基因编辑后代鉴定提供了简单、快捷的方法。