赤子爱胜蚓脱氧核糖核酸酶酶动力学研究

目的对赤子爱胜蚓中一组新型脱氧核糖核酸酶(EWDs)进行酶动力学研究。方法运用单相酶扩散法(SRED)、紫外分光光度法和林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法。结果EWDs的最适温度均为37℃。EWD1的最适pH为5.2,Km为1.58mg/ml,Vmax为5.36mg·ml-1·min-1;EWD2的最适pH为4.4,Km值是3.95mg/ml,Vmax值为2.87mg·ml-1·min-1;EWD3的最适pH为4.8,Km值是1.52mg/ml,Vmax值为4.89mg·ml-1·min-1。Mn2+和Ca2+是EWDs的抑制剂,Mg2+仅抑制EWD3的活性。结论蚯蚓组织中发现的此组脱氧核糖核酸酶具有特殊的酶学性质,区别于已知的脱氧核糖核酸酶类。

HPLC法测定大鼠UGT1A6的酶活性及体外动力学分析

目的:建立灵敏、稳定的高效液相色谱法,以对硝基酚为探针底物,评价体外大鼠肝微粒体中UGT1A6酶活性。方法:色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为20 mmol.L-1磷酸二氢钾缓冲液-甲醇(50∶50,V/V),流速0.8 mL.min-1,柱温30℃,检测波长280 nm。对硝基酚与大鼠肝微粒体在37℃共同孵育一段时间后,加入冰乙腈终止反应,于4℃下12000 r.min-1离心15 min后,吸取上清进行HPLC分析,以双倒数作图法计算酶动力学参数。结果:对硝基酚保留时间为8.95 min,线性范围为0.5～100μmol.L-1,回归方程为Y=5973.12X+571.58(r=0.9999),最低检测限(LOD)为0.1μmol.L-1(S/N≥3),最低定量限(LLOQ)为0.5μmol.L-1,回收率为104.5%～105.5%,日内、日间RSD均小于10%,温孵体系中其他内源性物质不干扰测定;计算酶动力学参数Km为24.63μmol.L-1,Vmax为18.87 nmol.min-1.mg.protein-1。结论:该方法灵敏度高、稳定性好,适合体外对硝基酚的测定,可用于大鼠体外UGT1A6酶活性的评价及酶动力学研究。