基于酶反应动力学理论优化脂肪酶活力测定体系

为了提高棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)法测定脂肪酶活力的灵敏度和准确度,以来源于Rhizopus oryzae的脂肪酶Lipase F-AP 15为研究对象,首先对其最适反应pH和反应温度进行优化,然后将表面活性剂作为激活因子引入酶活力测定体系,探究影响机制,并依据酶反应动力学理论优化测定条件(底物浓度、酶质量浓度、反应时间),对优化的p-NPP法的重复性和准确性进行了检验,最后以另一个来源的脂肪酶Lipase-PPL为模型,以同样思路与方法改进与优化其酶活力测定体系,以考察优化方法和思路的适用性。结果表明:表面活性剂PEG 8000的引入使得覆盖在脂肪酶活性位点的α-螺旋结构被重排而打开,脂肪酶由封闭构象转为并保持在活化构象,脂肪酶活性增强;优化测定体系的最适条件为pH 8.0、反应温度30℃、酶质量浓度1.00 mg/mL、底物浓度6 mmol/L、反应时间5 min,在此条件下测得的酶活力是常用p-NPP法(pH 8.0、反应温度30℃、酶质量浓度2.50 mg/mL、底物浓度10 mmol/L、反应时间8 min)测得酶活力的1.4倍;重复性和准确性试验显示,优化p-NPP法重复测定结果的相对标准偏差为1.21%,加标回收率为95.60%,均优于常用p-NPP法;优化方法和思路适用于其他来源的脂肪酶活力测定体系的优化。综上,通过将表面活性剂引入p-NPP法的脂肪酶活力测定体系,以酶反应动力学理论为指导优化测定条件,明显提高了方法的灵敏度,并有效保证了测定结果的重复性和准确性,缩短了检测时间,节省了检测成本。

酶反应动力学及人血清中手性氨基酸的LIE—CE研究

手性分析在生命起源研究、生命科学研究、药物研究、疾病研究、食品研究等领域中具有极其重要的研究意义。近年来，手性离子配体交换技术在手性氨基酸的分析的应用备受关注。本研究建立了了以Zn（Ⅱ）为中心离子的手性氨基酸离子配体交换毛细管电泳方法（LIE—CE）及氨基酸的丹酰氯在线衍生技术，并进一步开展了人血清中手性氨基酸的分析及酶反应动力学的研究。

苹果梨中多酚氧化酶酶反应动力学和反应进程的研究

本实验研究了苹果梨在不同贮藏条件下,多酚氧化酶酶活性的变化;并以酶促反应中底物的消耗量和产物的生成量为目标,对多酚氧化酶酶反应动力学进行了研究。

Kalman滤波用于酶反应动力学的研究

采用卡尔曼滤波研究酶反应动力学及分析，依据酶存在下过氧化氢放出氧的反应建立了扩展Ｋａｌｍａｎ滤波（ＥＫＦ）模型，用滤波处理确定了反应速率与起始速率浓度的关系，并估算出酶反应动力学参数Ｋｍ。采用滤波新方法测定分析物起始浓度。从而建立了一种新的研究酶反应的有效方法，使过氧化氢电极具有更好的可靠性和实用性。

生物法净化有机污染物的酶反应动力学修正

以生化法处理有机污染物的系统为讨论对象 ,从底物负荷影响微生物生长的角度出发 ,通过对有机污染物负荷与生化反应速度之间的关系的分析 ,得出进口底物浓度的大小会影响生物反应器内微生物的量的多少 ,从而影响器内的生化反应速率的结论 ,并按照“稳定平衡”假说的设想 ,建立了修正的Michaelis

基于邻苯二胺-过氧化氢反应体系的过氧化物酶反应动力学研究

过氧化物酶(peroxidase,POD)是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于细胞的过氧化物酶体中,是动植物代谢中应用广泛的一类催化聚合酶。本文基于邻苯二胺(OPDA)-过氧化氢(H2O2)反应体系,对商品辣根过氧化物酶(HRP)和土豆中的过氧化物酶进行了酶反应动力学的研究。

草甘膦N-乙酰转移酶反应动力学研究

草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetytransferase,GAT)是一种能够通过转乙酰基的反应将草甘膦代谢为低毒物质乙酰草甘膦的酶,在抗除草剂转基因作物中具有潜在的应用价值。通过将地衣芽孢杆菌Ba-cillus licheniformis(Weigmann)Chester AB 94036中的草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetyltransferase,GAT)基因克隆到大肠杆菌中,获得含有重组质粒pGEX 6p-1-gat的重组菌株。对重组菌株进行诱导表达,经过GST亲和层析纯化,获得约17 ku的目的蛋白。通过酶标仪和连续分光光度分析法,对GAT蛋白进行了酶反应动力学测定。研究表明GAT的催化常数kcat为6.420 min-1,米氏常数KM为1.162 mmol/L,由此得出其催化效率kcat/KM为5.52 L/(mmol.min)。

丙烯腈水合酶反应动力学与酶失活动力学研究

在以丙烯腈为原料,微生物转化生产丙烯酰胺的过程中,酶催化反应是过程的关键。为了了解酶催化的动力学,以自由细胞的酶为催化剂,进行了腈水合酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶催化反应速度的影响。结果表明,在这些因素中,温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。经过对不同温度下的反应速度的研究,得到腈水合酶水合反应的活化能为Ea=60.87kJ/mol,酶失活反应的活化能为89.36kJ/mol。

类普鲁士蓝纳米酶材料的制备及其酶催化反应动力学探究——推荐一个分析化学综合实验

将类普鲁士蓝纳米酶引入本科实验教学,设计了一个探究性的分析化学综合实验,实验内容包括三种类普鲁士蓝纳米酶材料的制备、表征和酶催化反应速率常数的测定,并将这些纳米酶材料应用于过氧化氢(H2O2)的分析检测。本实验所用试剂价廉易得、反应条件温和、实验现象直观、时间分配合理,适合本科实验教学,用于提升学生的实验技能和科研创新能力。

微生物法生产丙烯酰胺的研究(Ⅱ)——腈水合酶催化反应动力学与失活动力学

在以丙烯腈为原料 ,微生物转化生产丙烯酰胺的过程中 ,酶催化反应是过程的关键。为了了解酶催化的动力学 ,本研究以自由细胞的酶为催化剂 ,进行了腈水合酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶催化反应速度的影响。结果表明 ,在这些因素中 ,温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。 2 8℃时酶活为 5 6 5 9u mL(菌液 ) ,在 5℃时的反应速率仅为 2 8℃时的11 72 % ,相应的表观酶活为 6 6 3u mL(菌液 )。而在丙烯酰胺 45 %浓度条件下的酶活大约只有丙烯酰胺 5 %浓度下的酶活的 1 2。经过对不同温度下的反应速度的研究 ,得到腈水合酶水合反应的活化能为 6 5 5 7kJ·mol- 1 。本文进一步研究了自由细胞状态下 ,菌体浓度、pH值、温度、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度对腈水合酶失活的影响 ,得到了失活动力学。结果表明 ,在这些因素中 ,对酶失活影响的最主要因素还是温度和丙烯酰胺浓度。尤其当丙烯酰胺浓度到达 35 %时 ,酶活下降得很快 ,在 5 5h后 ,酶活几乎为零。而在丙烯酰胺浓度为 10 %的情况下 ,5 5h的酶活仍然还存在约 5 0 %。试验结果还表明 ,丙烯腈对酶的稳定性的影响很小。经过数据处理 ,得到的 2 8℃的酶失活速率常数为 5℃下的 2 1

大鼠肝微粒体中间尼索地平的HPLC法测定与酶促反应动力学

建立了HPLC法测定大鼠肝微粒体中的间尼索地平及相应的酶促反应动力学。采用C18色谱柱,乙腈-水(62∶38)为流动相,检测波长237nm,样品经氢氧化钠溶液碱化后用乙醚-正己烷(1∶1)萃取。间尼索地平在1.56～100μmol/L浓度范围内线性关系良好。本法的相对回收率为93.0%,RSD为3.75%;日内、日间RSD分别为6.04%和1.53%。

大鼠肝细胞液体外甲基化代谢丹酚酸A的酶促反应动力学

目的筛选大鼠肝细胞液作为儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)供体,建立丹酚酸A(SAA)体外孵育甲基化代谢的酶促反应。方法采用HPLC-UV法检测孵育体系中底物SAA的浓度,根据底物消耗量计算SAA的体外酶促代谢反应速度和动力学参数。结果在大鼠肝细胞液体外温孵体系中,SAA的酶促甲基化代谢反应呈现饱和动力学特征,符合Michaelis-Menten曲线,最大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km)分别为30.4 nmol·mol-1·min-1,0.179 mmol·L-1。结论大鼠肝脏的COMT酶对SAA有较强的亲和力,可催化SAA发生快速、完全的甲基化代谢,大鼠肝细胞液与SAA在控制条件下体外温孵是高收率、选择性制备SAA甲基化代谢产物的一种有效手段。

黄皮酰胺对映体在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学

目的 研究黄皮酰胺 (clausenamide ,Clau)对映体在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学并比较其立体选择性差异。方法 应用反相HPLC法测定Clau对映体在体外代谢系统中的产物 ,并用Eadie Hofstee作图法分析数据、求算酶促反应动力学参数Km 和Vmax以及肝代谢速率Vmax Km。结果 在体外代谢系统中 ,左旋黄皮酰胺主要生成 7 羟 Clau、5 羟 Clau和 4 羟 Clau ,其优势代谢途径为 7位羟化 ;7位羟化代谢的Vmax Km 值高于 5位和 4位。右旋黄皮酰胺的 4位羟化反应Km 最小、Vmax最大 ,因此代谢速率最高 ,是左旋体 4位羟化的 8倍 ;而其 7 羟 Clau和 5 羟 Clau的产生量很小。结论 黄皮酰胺对映体在大鼠肝微粒体中的羟化代谢存在明显的底物立体选择性差异。

瑞格列奈在人肝微粒体中的酶促反应动力学及葛根素对其代谢的影响

目的通过体外人肝微粒孵育实验考察瑞格列奈的酶促反应动力学,并研究葛根素对瑞格列奈代谢的影响。方法以阿托伐他汀为内标,建立UPLC法测定人肝微粒体中瑞格列奈的浓度。建立人肝微粒体体外孵育体系,确定最佳蛋白浓度和孵育时间;采用原形药物减少法,通过GraphPad Prism 5.0软件计算酶促反应动力学参数(V_(max)和K_(m));系列浓度葛根素(0~50μmol·L^(-1))与瑞格列奈(5.5μmol·L^(-1))在肝微粒体孵育体系中于37℃水浴共同孵育,测定肝微粒体中瑞格列奈的浓度,并计算减少量,从而考察葛根素对瑞格列奈代谢的影响。结果瑞格列奈在人肝微粒体的最佳蛋白质量浓度为0.5 mg·mL^(-1),最佳孵育时间为40 min;酶促反应动力学参数V_(max)=1.71μmol·min^(-1)·(mg·protein)^(-1),K_(m)=5.66μmol·L^(-1)。结论UPLC法测定人肝微粒体中瑞格列奈的浓度,灵敏度高、操作简便。通过人混合肝微粒体孵育实验得到瑞格列奈的酶促反应动力学参数,且进一步研究显示葛根素对瑞格列奈在人肝微粒体未产生显著的抑制作用,可为两药的联合应用提供参考。

恒定磁场对α-淀粉酶反应过程的影响及磁场中的酶促反应动力学

随着磁场生物效应的研究和应用的发展,人们发现了磁场对某些酶活性的影响~{1-3}。

大鼠肝微粒体中钩吻素子UPLC-MS/MS法测定与酶促反应动力学研究

目的建立UPLC-MS/MS法测定大鼠肝微粒体中钩吻素子的浓度及其酶促反应动力学研究。方法优化钩吻素子与肝微粒体的反应体系,采用UPLC BEH C18色谱柱,流动相为甲醇-水(两者均含0.1%甲酸),梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,进样量为1μL,质谱采用正离子,MRM模式检测孵育体系中钩吻素子的浓度,并应用Linewearve-Burk作图分析数据,计算酶促动力学常数。结果钩吻素子在0.5～30μM范围内线性良好,回归方程为y=0.1544x-0.0593(r=0.9939,n=5)。钩吻素子的酶促反应动力学参数Km为14.2μmol/L,Vmax为303.03pmol/(min.mg.pro)以及肝清除率CLint(Vmax/Km)为21.37μL/(min.mg.pro)。结论该方法简单、快速、可靠,适应于钩吻素子的体外代谢研究。

Hirulog-s纤溶酶促反应动力学的常数测定

Hirulog-s为军事医学科学院通过对水蛭素结构改造获得的一种新型合成水蛭肽,其序列为：（D）-FPRP-GK（Stearic acid）-GG-QGDFEPIPEDA-YDE-NH2,Hirulog-s半衰期达到T1/2=212.2±58.4min.水蛭素具有间接促进尿激酶诱导的纤溶作用,为考察新型水蛭肽Hirulog-s影响纤溶因子亲和性的程度,本文基于单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（pro-uPA）和纤溶酶原（plg）的相互活化作用研究Hirulog-s通过酶促反应动力学参数体现出来的纤溶特性.

生物化学说课稿——《酶促反应动力学》

结合实践,从说课程、说教法、说学法、说教学过程、教学评价分析和说板书设计六个方面来阐述对生物化学中"酶促反应动力学"的设计思路。

异育银鲫肝微粒体体外恩诺沙星N-脱乙基酶酶促反应动力学初步研究

建立了异育银鲫肝微粒体体外孵育恩诺沙星(enrofloxacin,EF)的酶促反应体系,应用RP-HPLC法检测其主要代谢产物环丙沙星(ciprofloxacin,CF),以间接反映恩诺沙星N-脱乙基酶的活性。采用二氯甲烷提取、正已烷去脂提取有效成分,样品回收率均大于81.4%,含CF或EF的肝微粒体样品能在4℃下稳定至少72 h,日内变异系数不超过3.51%,日间变异系数不超过3.71%,EF和CF准确度分别小于8.1%、6.5%,检测限(信超比为3)分别为0.15μmol/L、0.3μmol/L。恩诺沙星在银鲫肝微粒体中代谢符合一级消除方程C=140e-0.072t,消除速率常数(K)为0.072/h,消除半衰期(T1/2)为9.627 h。用Origin Lab软件的Hyperbl模型进行拟和,以方程y=P1.x/(P2+x)表示米氏常数Vmax、Km两者的关系,求得Vmax为0.2602±0.0147nmol/mg.min,Km为53.8985±10.2257μmol/L,内在清除率(Clint)约为0.0048 mL/(min.mg)。恩诺沙星消除率和环丙沙星转化率的研究结果提示,恩诺沙星在银鲫肝微粒体中的代谢以N-脱乙基反应为主,提示可能还通过其它途径生成另外代谢产物。而酶动力学研究数据(Vmax,Clint值)表明,恩诺沙星N-脱乙基酶与底物结合力不强,酶促反应强度处于中等水平。据此,笔者推测恩诺沙星在银鲫肝微粒体中的代谢速度较为缓慢。