基因治疗药物AAV5-脂蛋白脂酶变异体临床前神经系统安全性评价

目的通过评价AAV5-脂蛋白脂酶变异体(GC304)腺相关病毒注射液对C57BL/6N小鼠中枢神经系统的影响,以确定受试物可能关系到人的安全性问题。方法共使用40只小鼠,雌雄各半,分别单次尾静脉给予溶媒对照、1.0×10^(13)、5×10^(13)、1.5×10^(14)vg·kg^(-1)GC304腺相关病毒注射液,采用功能观测组合试验方法(FOB),分别在给药前和给药后1、4、24、48、96 h,7、14 d观察小鼠运动功能、感觉功能、自主活动等行为,评价受试物对小鼠中枢神经系统的影响,并在给药后第14天检测血清TG、白蛋白和总蛋白改变。结果本研究前期,采用荧光定量PCR方法检测小鼠脑中目的基因(LPL),其结果显示给予1.5×10^(14)vg·kg^(-1)GC3042周后,仍可在脑区内检测到目的基因(LPL)的拷贝数,基于上述数据开展了GC304行为学检测,其结果显示给予GC304后,可引起与药理作用相关的甘油三酯的明显降低,但在给药后2周内,GC304各剂量组动物笼内观察、手持观察、开放场观察、反射评价各指标均未见明显异常。结论GC304可进入脑区,且给药后14 d内,目的基因在脑区内仍有少量分布,但其不会诱导产生神经毒性,为临床用药提供了参考。

基因治疗药物AAV5-脂蛋白脂酶变异体在小鼠体内的毒性研究

目的评估基因治疗药物AAV5-脂蛋白脂酶变异体(GC304)在小鼠体内的毒性。方法(1)急性毒性研究中,40只C57BL/6N小鼠随机分为2组,分别为溶媒组和受试物组,单次尾静脉注射后,进行连续15 d临床症状观察、体重和摄食量测定,于第15天剖检。(2)长期毒性研究中,440只小鼠随机分为4组,分别设置溶媒组,受试物低剂量组(1×10^(13)vg·kg^(-1))、中剂量组(5×10^(13)vg·kg^(-1))和高剂量组(1.5×10^(14)vg·kg^(-1)),单次尾静脉注射后,对动物体重、摄食量、血液学、血清生化、免疫毒性及免疫原性等毒性指标进行测定。给药后4周和6个月时解剖,动物进行组织病理学检查,并在2、4周,3、6个月采用q PCR的方法检测GC304在动物各个脏器的分布和表达情况。结果(1)急性毒性研究中,动物临床症状、体重、摄食量未见异常,未见与GC304相关的大体病理学改变。(2)长期毒性研究中,动物临床症状、体重、摄食量、细胞因子和T淋巴细胞亚群未见与GC304相关的明显异常。GC304能够降低血浆中甘油三酯以及与抗药抗体相关的白蛋白/球蛋白比值下降,能够诱导抗AAV5结合抗体和中和抗体的产生,并持续至给药后6个月。给予GC304后,未检测到抗脂蛋白脂肪酶(LPL)抗体。组织病理学结果显示,小鼠给药后4周,注射部位出现与药物相关的炎性细胞浸润,至给药后6个月可见恢复。与药物相关的改变为脾脏生发中心活跃伴易染体巨噬细胞增多、腹股沟淋巴结生发中心活跃伴易染体巨噬细胞增多。qPCR检测结果显示,GC304在小鼠外周血及脏器广泛分布和表达,但在肝脏中分布和表达显著高于其他脏器。结论C57BL/6N小鼠单次静脉给予GC304后,主要在肝脏中表达和分布,并且动物耐受性良好,未见明显毒性反应,为该药物进入临床试验提供参考。

基因治疗药物AAV5-脂蛋白脂酶变异体在食蟹猴体内的毒性研究

目的评估基因治疗药物AAV5-脂蛋白脂酶变异体(GC304)在食蟹猴体内的毒性。方法30只食蟹猴,分为溶媒对照组(静脉注射溶媒)、GC304低剂量组(3×10^(13)vg·kg^(-1))和高剂量组(1×10^(14)vg·kg^(-1))。试验期间,所有动物进行临床症状和注射部位观察,每周进行摄食量和体重测定。在给药前后不同时间点进行免疫原性检测(包含抗AAV5结合抗体、中和抗体及抗LPL结合抗体)、血液学、血清生化、血凝和尿生化检查,并同时进行T淋巴细胞分型、细胞因子、心电、血压、体温和眼科检查。给药后4周和6个月解剖,动物进行大体观察、脏器称重和组织病理学检查,同时进行GC304的生物分布研究及表达产物测定,并在不同时间点对血液中目的基因DNA进行检测。结果受试物对食蟹猴临床症状、注射部位、体重、摄食量、眼睛各项指标、体温、血压、心电图、血凝、血清生化、T淋巴细胞分型、尿液、细胞因子、脏器重量等指标未见影响。高剂量组动物给药后4周血小板下降。与给予受试物相关的组织病理学改变为脾脏和腹股沟淋巴结生发中心活跃伴易染体巨噬细胞增多。低剂量和高剂量均可引起食蟹猴产生抗AAV5结合与中和抗体,给药后6个月2种抗体仍维持在较高的水平,但未见明显的剂量-效应关系。给予GC304后,未显著诱导食蟹猴产生抗LPL抗体。qPCR检测结果显示,受试物在食蟹猴外周血及脏器广泛分布和表达,但主要集中在肝脏。结论食蟹猴单次静脉给予GC304,动物耐受性良好,未见明显毒性反应,且主要在肝脏中分布和表达,为该药物进入临床试验提供参考。

番茄泛素结合酶变体基因鉴定及表达分析

【目的】开展番茄泛素结合酶变体(UEV)家族基因鉴定、组织特异性和非生物胁迫表达模式分析,为阐明UEV基因在番茄生长和逆境响应中的功能研究奠定基础。【方法】利用已知拟南芥UEV家族基因为探针,在番茄基因组数据库中查找并下载番茄UEV基因序列,同时查找其CDS、氨基酸长度及染色体位置等信息。利用生物信息学方法,通过在线工具GSDS 2.0、Expasy-protparam、Plant-PLoc、MEME对获得序列的基因结构、蛋白质分子量、等电点、亚细胞定位、保守结构域、保守基序原件等进行预测和分析。利用ClustalX(1.83)和MEGA 6.0软件进行同源序列比对并构建系统进化树。运用实时荧光定量RT-PCR分析番茄UEV基因组织表达特异性及高盐、干旱、高温、低温胁迫下UEV基因的表达差异。【结果】从番茄基因组数据库中共鉴定到5个UEV家族基因,分别命名为SlUEV1~SlUEV5,分布在1、4、10三条染色体上。SlUEV的CDS长度为441~855 bp,氨基酸数目为146~284 aa,分子量在16.2~33.14 kD。SlUEV分为3个亚家族,其中SlUEV1、SlUEV2、SlUEV5属于UEV1亚家族,且其基因结构、保守结构域和保守基序均相似;SlUEV4属于COP10亚家族,而SlUEV3在拟南芥中并未找到同源蛋白,表明UEV家族在进化过程中发生分离。组织表达分析发现SlUEV1、SlUEV3分别在番茄花和茎中表达量高,SlUEV4在果实发育期表达量高,而SlUEV2和SlUEV5呈组成性表达。非生物胁迫试验发现SlUEV对干旱胁迫较为敏感,多个SlUEV基因上调表达,表明SlUEV基因响应番茄干旱胁迫。【结论】番茄基因组中包括5个UEV家族基因,系统进化树分析将其分为3个亚家族。多个SlUEV基因在番茄不同组织表达存在差异,表明UEV基因影响番茄的生长发育。多个SlUEV基因在干旱胁迫下显著上调表达,推测其在番茄适应干旱胁迫过程中起着重要作用。该研究为后续开展番茄UEV基因调控植物生长和逆境胁迫功能研究提供理论基础。

酶变蔗渣浆漂白工艺的改进

1.问题的起因: 我厂蔗渣遮盖问题一直未解决,堆垛场地也相当有限,虽然近年来我们在蔗渣堆垛方面采取了一些防止通风道垮塌的措施和加强管理。但每年七月份后随气温的升高和频繁的暴雨还是造成蔗渣酶烂。轻者发红。

柚品种的等位酶变异

研究柚的48个品种的等位酶变异。利用等位酶分析技术对柚的脂酶(EST)、6—磷酸葡萄糖异构酶(PDI)、6—磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、莽草酸脱氢酶(SKD)、超氧化物歧化酶(SOD)

褪黑素对鲜切山药酶促褐变的作用效果

分别采用1、2、3 mmol/L的褪黑素溶液处理鲜切铁棍山药,以蒸馏水浸泡鲜切山药为对照,室温(25℃)下存放4 d,测定鲜切山药颜色参数(L^(*)、a^(*)、b^(*)、总色差值(ΔE))、多酚氧化酶(PPO)活性、过氧化物酶(POD)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、H2O2含量、脂氧合酶(LOX)活性、丙二醛(MDA)含量、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率等指标,探究褪黑素对鲜切山药酶促褐变的作用效果。结果表明:褪黑素处理能抑制鲜切山药中PPO、POD、PAL和LOX活性,贮藏4 d时,3 mmol/L褪黑素处理的样品的PPO、POD、PAL和LOX活性比空白对照组的分别小51.6%、65.6%、27.1%、24.6%;褪黑素处理能降低山药中H2O2和MDA含量,贮藏4 d时,3 mmol/L褪黑素处理的样品的H2O2和MDA含量相比空白对照组的分别降低了84.8%和21.0%;褪黑素处理能提高山药中CAT活性,贮藏4 d时,3 mmol/L褪黑素处理的样品的CAT活性为空白对照组的1.96倍;褪黑素处理能提高山药的DPPH和ABTS自由基清除能力,贮藏4 d时,3 mmol/L褪黑素处理样品DPPH和ABTS自由基清除率比空白对照组的分别提高了20.6%、18.7%;褪黑素处理也能有效延缓鲜切山药表面褐变,且其效果具有浓度依赖性,3 mmol/L的褪黑素护色效果最好,贮藏4 d时,3 mmol/L褪黑素处理的样品的L^(*)值比空白对照组大32.5%,a^(*)、b^(*)、ΔE比空白对照组分别小74.0%、50.7%、67.3%;相关分析结果显示,鲜切山药的ΔE与L^(*)、a^(*)、b^(*)、PPO活性、POD活性、PAL活性、H2O2含量和MDA含量均呈极显著相关,与ABTS自由基清除率呈显著相关。

蓝靛果打浆过程中酶促褐变机制及其抑制剂研究

为解决蓝靛果打浆工艺单元的酶促褐变现象,提高蓝靛果的利用价值。实验研究蓝靛果在打浆工艺中主要参与酶促褐变反应的酚类底物及其抑制能力,并分析酚类底物与表儿茶素对多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)反应的相互作用,进而确定酶促褐变机理。并进一步通过对比抗坏血酸、L-半胱氨酸、氯化钙、EDTA-2Na、柠檬酸添加量对褐变抑制率的影响,筛选出效果最佳的三种抑制剂。结果表明,蓝靛果打浆工艺中参与酶促褐变的首要影响因素是表儿茶素,并且表儿茶素对PPO的淬灭机制为静态淬灭。响应面优化试验确定复合抑制剂的最佳组合为:抗坏血酸添加量0.11%、L-半胱氨酸添加量0.11%、EDTA-2Na添加量0.08%,该条件下蓝靛果汁的褐变抑制率为93.17%。说明选用以上复合抑制剂可抑制蓝靛果打浆工艺中的酶促褐变。

干制前处理对切分杏褐变内源酶及色泽的影响

目的:采用4种方式对切分杏干制前进行处理,研究对多酚氧化酶、过氧化物酶及色差的影响,确定切分杏干制前处理的最佳条件。方法:以切分、去核的赛买提杏为材料,探究热水、蒸汽漂烫、微波处理、浸硫处理的杏果内源酶活性、失活率和色差的变化,研究4种最佳前处理条件下对杏果色差(干制前后)的影响,并进行色差各指标间的相关性分析。结果:热水、蒸汽漂烫下酶活性随热烫时间的增加而降低,100℃、90 s为该处理的最佳条件;微波处理下内源酶失活率随功率的增大、时间的延长而增加,最佳条件为50%(350 W),5 min,失活率分别为92.83%、91.05%;浸硫处理下酶失活率分别为98.73%、16.35%。结论:热水漂烫和浸硫处理结合热风干燥在温度为60℃时色泽保持较好,而蒸汽漂烫和微波处理选择40℃为宜。通过相关性分析得出热水漂烫对杏干色泽损伤较大,硫处理可有效保持杏干色泽。

茯苓多糖合成途径磷酸葡萄糖变位酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因鉴定

采用已报道的灵芝磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPP)基因序列对茯苓基因组进行搜索比对,获得茯苓WcPGM和WcUGPP候选基因序列;以茯苓的cDNA为模板,成功克隆获得WcPGM和WcUGPP基因;随后利用pPIC9K构建2个基因的表达载体,并转化至毕赤酵母进行异源表达。序列分析表明WcPGM和WcUGPP基因全长分别为2021 bp和2144 bp,其中WcPGM基因含有5个外显子和4个内含子,编码564个氨基酸;WcUGPP基因含有11个外显子和10个内含子,编码502个氨基酸。氨基酸序列比对表明,WcPGM和WcUGPP与来源于绣球菌的ScPGM和ScUGPP的同源性分别为87%和91%。酶活测定表明,重组酶WcPGM可转化葡萄糖-1-磷酸(G1P)为葡萄糖-6-磷酸(G6P),酶活达1540 U·mL^(-1);重组酶WcUGPP可催化G1P和尿苷三磷酸(UTP)合成UDP-葡萄糖(UDP-Glc),酶活达660 U·mL^(-1),表明从茯苓中筛选到的2个酶WcPGM和WcUGPP具有PGM和UGPP活性。分子模拟表明,WcPGM在催化可逆反应过程中S114为磷酸供体和受体,R24和K379作为催化酸和碱实现底物的磷酸化和去磷酸化,而E366和S368可实现底物的2种朝向,保障了中间产物葡萄糖-1,6-二磷酸的翻转,确保了WcPGM的可逆反应;而WcUGPP活性中心的核苷酸结合Loop和糖结合Loop保障了底物的正确朝向,K390作为催化碱实现了底物UTP/G1P与UDP-Glc的可逆反应。该研究为茯苓多糖合成途径的解析和代谢工程提升茯苓多糖产量奠定了基础。

桃酶促褐变机理与调控技术研究进展

桃是我国古老的果品之一,极具营养价值和商品价值。桃是典型的呼吸跃变型果实,采后贮运中内部易发生褐变,且桃加工中褐变速率快、程度高,较难控制,对果实品质和经济价值造成影响。目前针对桃加工褐变特征和机理研究的系统性不强,调控技术方法针对性不足,效果不明显。本文针对桃果实酶促褐变特征、机理、褐变关键因子及褐变调控手段等相关国内外研究现状进行梳理,并对桃酶促褐变调控技术进行梳理,旨在为桃贮藏及加工中酶促褐变的调控提供参考,促进桃鲜食和加工制品的品质提升。

基于主成分分析和隶属函数法对不同马铃薯酶促褐变评价

褐变是影响马铃薯加工业快速发展的一个限制因素,褐变评价对抗褐变马铃薯品种选育及马铃薯鲜切加工发展具有重要意义。以45个马铃薯品种作为试验材料,对10个酶促褐变相关指标进行测定,再结合相关性分析、主成分分析、隶属函数和聚类分析进行综合评价。结果表明,可以通过鲜薯切片0 h和6 h亮度值、褐变强度(BD)初始值和多酚氧化酶(PPO)活性4个指标进行马铃薯酶促褐变的鉴定评价;根据抗酶促褐变能力将45个马铃薯品种分为5种类型,其中高抗酶促褐变材料5份、抗酶促褐变材料9份、中度酶促褐变材料18份、易酶促褐变材料9份和极易酶促褐变材料4份。

果蔬制品非酶褐变机理及控制技术研究进展

非酶褐变是果蔬加工和贮藏过程中易发生的化学反应,涉及多种化合物与化学途径,反应机理相对复杂。该文在已有研究的基础上,阐述果蔬制品非酶褐变的原因及影响因素,对果蔬加工及贮藏中的美拉德反应、抗坏血酸氧化分解、多元酚氧化缩合和焦糖反应等非酶褐变机理进行介绍,综述果蔬褐变控制技术,并对应用前景进行展望,旨在为果蔬制品的褐变控制提供参考。

牛油果酶促褐变复合抑制措施研究

以牛油果为研究对象,通过对其果肉中多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的活性进行探究,预测不同理化因素(pH值、超声、化学抑制剂等)对牛油果酶促褐变的影响.首先利用单因素实验分别研究不同pH值、超声时长、化学抑制剂浓度对牛油果果肉PPO活性的影响,进一步通过正交试验确定最佳复合酶促褐变抑制措施.结果表明,最佳复合抑制方案为:pH7.0,超声处理时长40 min,抗坏血酸添加浓度0.1%,L-半胱氨酸添加浓度0.0375%,7 d内储存的酶促褐变抑制率为93.9%.研究为牛油果及其副产品的储存与加工提供了有效的保鲜方法,有利于提高牛油果的食用品质和商品价值.

人参UDP-阿拉伯糖变位酶基因电子克隆及分析

UDP-阿拉伯糖变位酶是阿拉伯糖合成过程的关键酶,在植物形态建成和逆境胁迫响应过程中起着重要的作用.UDP-阿拉伯糖变位酶可使UDP-Araf和UDP-Arap相互转换,参与包括阿拉伯糖在内的多糖合成.以玉米UDP-阿拉伯糖变位酶氨基酸序列作为探针,通过电子克隆的方式,对人参EST数据库进行检索,获得具有高度同源性的cDNA序列,采用DNAMAN软件对其进行拼接和组装,最终获得一条长为1445 bp的cDNA序列.利用相关软件对人参UDP-阿拉伯糖变位酶基因进行生物信息学分析.结果表明:人参UDP-阿拉伯糖变位酶蛋白为稳定的亲水性蛋白,该蛋白上的磷酸化修饰有33处,无跨膜螺旋区,不存在信号肽,为非分泌蛋白.该蛋白含有无规则卷曲、α螺旋、延伸链、β折叠二级结构,其中无规则卷曲结构最多.人参UDP-阿拉伯糖变位酶的氨基酸序列与凤仙花同源性较高,与石榴花同源性较低.分析结果能为人参后续相关研究提供一定的参考依据.

抗褐变抑制剂对果蔬多酚氧化酶的影响

果蔬的褐变问题对农户造成了很大的经济损失。在生产贮藏过程中,由于酶促褐变产生的对果蔬色泽、感官、及营养品质的负面影响大大降低了果蔬市场的经济效益。褐变是果实成熟老化生理衰退和果实品质劣变的特征之一,本质上是根据是否有酶的参与分为酶促褐变和非酶促褐变。

地黄不同炮制品的抗氧化及酶促褐变反应活性比较研究

目的通过对鲜地黄、生地黄及熟地黄的抗氧化活性及褐变酶活性进行检测及相关性分析,揭示地黄不同炮制品之间抗氧化活性的差异并为相关机制研究奠定一定的理论基础。方法用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azobis-3-ethylbenzoinesulfonic acid,ABTS)和铁离子还原/抗氧化能力法(ferric reducing antioxidant potential,FRAP)3种体外抗氧化模型对鲜地黄、生地黄及熟地黄的醇提取物和水提取物的抗氧化活性进行比较。同时通过检测多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)和过氧化物酶(peroxidase,POD)2种褐变酶的活性来评价鲜地黄、生地黄及熟地黄的酶促褐变反应的活性。结果地黄的不同炮制品均有一定的抗氧化活性,且3种体外抗氧化模型的实验结果基本一致;在水提取物实验中,地黄不同炮制品的抗氧化活性依次为鲜地黄>熟地黄>生地黄;在醇提取物实验中,地黄不同炮制品的抗氧化活性依次为鲜地黄>生地黄>熟地黄。本实验通过对PPO和POD 2种褐变酶的活性进行检测和分析发现,地黄不同炮制品的褐变酶活性差异较大,且PPO和POD 2种褐变酶的活性实验结果基本一致;地黄不同炮制品的PPO和POD 2种褐变酶的活性从高到低依次为生地黄>鲜地黄>熟地黄。结论本文通过对地黄不同炮制品的抗氧化活性与褐变酶活性的综合比较和分析可知,地黄不同炮制品的抗氧化活性与酶促褐变反应有一定的相关性。

文成糯米山药的氧化酶含量分析

为了了解文成糯米山药本底氧化酶含量,促进采后加工的技术研究和开发,以文成县7个糯米山药规模主体样品为研究对象,开展2年的跟踪分析,获得糯米山药中多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等氧化酶含量的定量数据。结果表明,糯米山药本底的氧化酶含量受年份、生产基地的影响显著,不同食用部位的氧化酶本底含量分别为:SOD 69.15~163.71 U/g、POD 112.34~363.75 U/g、PPO 123.84~195.18 U/g。糯米山药的氧化酶含量和褐变程度为:中部>底部>上部。研究结果为糯米山药的采后贮藏和品质控制提供参考。

不同贮藏温度下枸杞馅料非酶促褐变主要途径探究

为探究枸杞馅料贮藏过程中褐变主要途径,将枸杞馅料置于4、25、37℃条件下贮藏60 d,分析枸杞馅料贮藏期内褐变度、5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)、类胡萝卜素、总酚、还原糖和氨基态氮等指标变化,并进行相关性和主成分分析。结果表明,随着贮藏时间延长,枸杞馅料褐变度、5-HMF含量均上升,而类胡萝卜素、总酚、还原糖和氨基态氮含量下降。相关性分析结果表明,37℃条件下,其褐变度与上述指标均显著相关(P<0.05),说明其贮藏过程中褐变来自于类胡萝卜素降解、多酚氧化和美拉德反应等多种途径的共同作用。主成分研究结果表明,不同贮藏温度和时间对枸杞馅料褐变度影响较大,其褐变度变化与各组分含量变化具有不同步性,25、37℃条件下,其褐变主要由总酚等活性物质氧化及美拉德反应共同导致,而37℃条件下,其美拉德反应的影响更为显著。该研究可为枸杞馅料的贮藏提供理论与技术支撑。