大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的酶学特征

【目的】研究大蒜(Allium sativum L.)中蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的酶学特征,为大蒜保鲜、加工和品质改良提供依据。【方法】采用饱和度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的硫酸铵分级沉淀1-SST,以确定其所在的硫酸铵部位。分别取1-SST活力最高的硫酸铵部分与底物蔗糖反应,研究其在不同的温度、p H、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖的能力,即采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD),测定1-SST反应前后的1-蔗果三糖的含量,进而计算出1-SST活力大小并总结出其在不同的温度、p H、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖反应的规律;采用的色谱柱为Prevail Carbohydrate ES柱(250 mm×4.6 mm,5μm),色谱柱柱温箱温度为40℃,流动相最大限压20 MP,流动相为乙腈和水,其流速为1.0 m L·min-1,ELSD撞击器关闭状态,漂移管温度90℃,载气流量2.5 L·min-1(空气)。其梯度洗脱方式为:0 min,75%乙腈﹕25%水;15 min,65%乙腈﹕35%水;30 min,50%乙腈﹕50%水;35 min,75%乙腈﹕25%水;40 min,75%乙腈﹕25%水。【结果】在上述测定条件下,果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖6种糖完全分离,出峰时间仅为20 min,测定方法可靠、灵敏度高,满足了测定1-SST活性的要求。以50%(w/w)蔗糖为底物时,仅产生1-蔗果三糖,无其它高果聚糖的产生,证实了在所试条件下,大蒜中1-SST反应具有专一性。大蒜1-SST主要存在于30%—40%硫酸铵饱和度部分,其中0—30%,40%—70%有轻微活力,未发现70%—100%硫酸铵组分有1-SST的活力。取30%—40%的硫酸铵饱和度部分作为样品研究1-SST酶学特征发现其最适反应温度为35℃,当温度到达40℃以上时,酶的活力下降的很快,说明1-SST具有热不稳定性,因此在研究大蒜1-SST时,要尽量避免高温,以免影响后续研究;其最适反应p H为5.0,与大麦(Hordeum vulgare)、菊苣(Cichorium intybus L.)、菊芋(Helianthus tuberosus Colombia)、黑麦草(Lolium rigidum)、龙舌兰(Agave americana L.)的1-SST最适p H大致相同,显示不同植物1-SST活力中心部位的结构可能基本一致;在蔗糖浓度为100—600 mg·m L-1内,酶活力随着底物质量浓度的增加而提高,而当底物浓度超过500 mg·m L-1时,酶活力增加的幅度减少而趋于平缓,这完全符合米氏方程(Michaelis-menten)的酶动力学性质;对于Na+、Cl-来说,离子强度越低,1-SST活力越强,1-SST在35℃下的米氏常数Km为104mmol·L-1。【结论】大蒜1-SST随温度、p H、离子强度、底物质量浓度等变化,不仅影响大蒜贮藏过程中的果聚糖代谢,也影响大蒜加工产品,尤其是大蒜提取物中糖的种类和含量。

链霉菌LD048硫化物氧化酶的催化机理及酶学特征

对硫化物氧化新菌株链霉菌LD048硫化物氧化酶的催化机理研究表明:S2-在硫化物氧化酶的作用下首先被氧化为S2O32-,然后生成SO32-,最后产生末端产物SO42-;O2对细胞生长是必须的,同时是反应过程中的电子受体。酶学特征研究说明:酶的最适反应温度为大于35℃,在80℃维持4 h酶活仍能完全保留;酶的最适反应pH为8.0;金属Mn2+是酶活性的有效促进剂,在实验浓度范围内酶活提高达35.6%;酶促反应的最适底物浓度为6.0 mmol/L。

舞毒蛾(Lymantria dispar)酚氧化酶的酶学特征及有机溶剂对其活性的影响

经35%饱和度硫酸铵分级沉淀,将舞毒蛾(Lymantria dispar)酚氧化酶部分纯化。测定该酶最适pH值为6.5,pH在6.5～7.5范围内酶保持稳定的活力。最适温度为35℃,当温度低于25℃时,酶具有稳定的活力。以L-多巴、邻苯二酚和焦性没食子酸为底物时,测定酚氧化酶对底物的专一性,结果表明其Km值分别为3.19、10.74和19.26 mmol.L-1。本实验还研究了有机溶剂对酶活力的影响,结果表明甲醇、乙醇、丙酮和二甲苯对舞毒蛾酚氧化酶都有持续的抑制作用,其IC50分别为0.450、.430、.41和0.13 mmol.L-1。

大蒜果聚糖外切酶的一些酶学特征研究

目的:研究大蒜(Allium sativum L.)果聚糖水解酶(FEH)的酶学特征。方法:采用硫酸铵分级沉淀确定FEH所在的沉淀组分,采用薄板层析和离子色谱法研究酶解产物,通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖的变化量计算酶活力,进而研究FEH的酶切位点,研究温度、pH值、离子强度、底物质量浓度对FEH活力的影响。结果:大蒜FEH存在于0～20%硫酸铵饱和度组分,根据酶解产物判断该酶属于外切酶,最适反应温度为45℃,最适反应pH值为5.5,最适离子强度为1.5mol/L氯化钠,最适反应质量浓度为4mg/mL。结论:存在于大蒜中的果聚糖外切酶会影响大蒜加工产品的质量和保鲜大蒜贮藏的糖代谢。

疏绵状嗜热丝孢菌外切β-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特征

【目的】疏绵状嗜热丝孢菌是一种嗜热丝状真菌,具有合成与分泌多种耐热酶的能力,从中找寻酶活高、耐热性能优良的β-葡聚糖酶。【方法】对疏绵状嗜热丝孢菌其中一个外切β-葡聚糖酶的编码基因gln B进行克隆,并在毕赤酵母GS115中表达。【结果】在摇瓶水平上重组菌的产酶活为11.5 U/m L,重组酶在SDS-PAGE中的大小约为48 k D。重组Gln B最适作用温度为65°C,最适作用p H为5.0;在低于50°C或p H 3.0-10.0之间具有良好稳定性。重组酶水解海带三糖,首先生成单糖和二糖,延长酶作用时间,可以进一步将其中的二糖部分水解为单糖。【结论】疏绵状嗜热丝孢菌来源的重组酶Gln B为外切β-葡聚糖酶,具有较好的耐热性能和p H稳定性。

Sulfolobus acidocaldarius DHH超家族核酸酶Saci0542的酶学特征研究

【目的】以嗜酸嗜热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的DHH超家族核酸酶(Saci0542)为例,研究其核酸外切酶活性特点,为阐明其在DNA代谢中的具体功能提供生化基础。【方法】将嗜酸嗜热硫化叶菌DHH超家族核酸酶Saci0542基因在大肠杆菌中重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯的重组蛋白;利用荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定Saci0542的酶学特征。【结果】重组表达的DHH超家族核酸酶Saci0542具有典型的单链核酸特异性的3ʹ-5ʹ外切酶活性。进一步酶学特征表征结果如下:酶活性依赖于二价金属离子Mn^(2+),而Ca^(2+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)等二价金属离子对活性没有明显的促进作用;Saci0542在pH 5.5–10的广泛范围内均表现出较高酶活性;高于200 mmol/L的NaCl强烈抑制酶活性;最适反应温度为50–55°C;末端磷酸基团抑制3ʹ-5ʹ外切酶活性。【结论】本研究证实,Saci0542是一种Mn^(2+)依赖型3ʹ-5ʹ外切酶,酶活性与NrnA核酸酶相似,可能在细胞内负责DNA修复或RNA的降解再循环利用。

黑曲霉酸性蛋白酶EXPA的克隆表达与酶学性质解析

酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料和皮革等行业具有重要的应用价值。然而,现有的酸性蛋白酶在50℃以上或pH> 3. 0时不稳定,限制了其应用范围。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIM F0510的酸性蛋白酶基因exp A在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组菌GS115 (p PIC-expA)。摇瓶发酵条件下,重组酶EXPA的酶活为257 380 RFU/h。生物信息学分析的结果显示,该酶属于天冬氨酸蛋白酶A1A家族。酶学性质的研究表明,该重组酶的最适反应温度和pH分别为50℃和3. 0;分别在40～50℃或pH 2. 5～3. 5孵育1 h后,仍能保留80%左右的活力。Zn^(2+)、Ca^(2+)、Fe^(2+)和Mn^(2+)对其活性有一定的促进作用;而Cu^(2+)、Co^(2+)、Fe^(3+)、EDTA和SDS则对其活性有显著的抑制作用。此外,重组酶EXPA对大豆分离蛋白、水溶性玉米蛋白和小麦水解蛋白均具有较好的水解作用。较好的耐热性和pH稳定性为EXPA在食品、饲料等领域的应用奠定了基础。

黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析

基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。

地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶嗜碱突变体的特征分析

地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶是工业上重要的蛋白酶类,进一步提高其在碱性条件下的活力可改善其在洗涤剂工业方面的应用价值。该研究通过筛选获得一种在碱性条件下酶活水平显著提高的地衣芽胞杆菌B186来源的蛋白酶,并在枯草芽胞杆菌WB600中对其编码基因进行了成功克隆与表达,获得了重组菌WB600(pHYE209)。然后通过离子交换色谱和凝胶层析法,从重组菌的发酵液中纯化获得了重组碱性蛋白酶AprE209。对酶学性质的研究表明,重组酶Apr E209的最适作用pH为11.0,最适作用温度为50℃,在30~37℃下和pH12.0时仍具有很高的活力。进一步通过生物信息学的手段对其耐碱机制进行了初步解析。该嗜碱突变体具有进一步用于洗涤剂的潜在研究价值。

双孢蘑菇易褐变菌株的多酚氧化酶特征

采用凝胶电泳等生化技术探讨了蘑菇易褐变菌株的酚酶特征。发现易褐变菌株具有特异的同工酶表型,子实体阶段表达的酚酶位点多,且酶活性高;其整个生活史的胞内酚酶活性曲线变化与优质菌株不同;所表达的酚酶对亚硫酸盐类酚酶抑制剂的敏感性低;所表达的酚酶较耐热,在加热的初始阶段(35～40℃)就能迅速催化褐变反应;所含的潜伏型酚酶含量大,且随着鲜菇贮藏期延长而大量活化,继续催化褐变。本文还就如何防止褐变进行了探讨。

黑曲霉羧肽酶CapA的克隆表达与酶学性质解析

通过对A.niger CBS 513.88基因组信息进行阅读和比对分析,发现一个新的丝氨酸羧肽酶基因CapA,并在毕赤酵母中进行克隆表达。在摇瓶发酵水平,重组菌GS115(pPIC9K-CapA)的羧肽酶酶活达到109.7 U/mL。酶学性质研究表明该酶最适温度和pH值分别为45℃和6.0;在30℃~50℃或pH 4.0~8.0孵育1 h,仍可保持80%或60%以上的活力;Mg^(2+)可以显著提高酶活,Cu^(2+)、Fe^(2+)、Co^(2+)和苯甲基磺酰氟则对酶活有明显的抑制作用。在6种被检测的底物中,CapA可以水解其中的5种,具有较广泛的底物特异性,并且偏好水解羧基端疏水性氨基酸亮氨酸和赖氨酸,苄氧羰基-苯丙氨酰-亮氨酸是其最适底物。CapA较好的耐热性和pH值稳定性以及水解底物特征表明其在食品和生物技术领域有较好的应用基础。

通过融合双亲短肽改善L-天冬酰胺酶酶学特性

L-天冬酰胺酶可以将L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸与氨,主要应用在医药与食品行业。作者尝试在L-天冬酰胺酶N-末端融合不同的自组双亲短肽,改善该酶的酶学特性。首先,利用分子克隆技术将6条分别具有不同特征的短肽与L-天冬酰胺酶的N-端融合,并在Escherichia coli BL21中进行表达,最后,利用Ni^(2+)-NTA纯化获得纯的重组L-天冬酰胺酶酶液。结果表明,融合SAP4对L-天冬酰氨酶(ans Z酶)动力学特征影响较大,融合蛋白SAP4-ans Z的比活力较融合前提高约30%,其中重组蛋白K_m值较原始酶下降了7.5%,而V_(max)值得提升了10%,说明融合SAP4可以改善ans Z酶对L-天冬酰胺的水解效率。

一种碱性γ-谷氨酰转肽酶在Bacillus subtilis 168中的分泌表达与酶学性质分析

将γ-谷氨酰转肽酶(GGT)在Bacillus subtilis 168同源过量表达,发现该酶能够自动分泌到细胞外,且重组菌酶活比原始菌提高了3 568倍。通过SDS-PAGE分析发酵液上清液发现,该γ-谷氨酰转肽酶是由一个相对分子质量为42 000的大亚基和一个22 000的小亚基组成。通过酶学性质分析发现,该γ-谷氨酰转肽酶是一个耐碱性的酶,最适反应pH为10;同时该酶具有良好的耐热性,最适反应温度达到50℃;另外,加入5.0 mmol/L的Mg^(2+)、Ca^(2+)、K^+、La^(3+)、Li^+和NH_4^+对GGT转肽活力具有明显的促进作用,其中添加的NH_4^+对GGT活力促进作用最为显著,GGT活力提高45%以上,而Cu^(2+)和Zn^(2+)则对其具有抑制作用。

产脂肪酶极端丝状真菌的筛选及其酶学特性

从南非德班市及其周边地区采集的76个土样中筛选得到99株嗜碱丝状真菌和51株嗜热丝状真菌,利用橄榄油乳化法以及对硝基苯酚法筛选得到三株具有底物专一性的菌株F4-173、F4-262、F8-67,经ITS分子生物学鉴定方法分别鉴定为Aspergillus fumigatus、Penicillium verrucosum、Penicillium chrysogenum。其中,Aspergillus fumigates F4-173可专一性分解菜籽油,其最适作用条件40℃、p H8.0,Penicillium verrucosum F4-262可专一性分解对硝基苯酚月桂酸酯,其最适作用条件为40℃、p H8.0,Penicillium chrysogenum F8-67可专一性分解大豆油,其酶液最适作用条件为50℃、p H6.5。

黑曲霉单宁酶TahA的克隆表达和酶学特性解析

单宁酶在茶饮料和医药等行业的应用受到了许多因素的限制,包括酶学性质研究的缺乏和较高的生产成本等。为此,该研究通过基因工程技术将黑曲霉CICIM F0510的单宁酶基因tah A在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组酶GS115 (pPIC-tahA)。摇瓶水平上,重组菌的单宁酶酶活为1. 04 U/mL。酶学性质的解析表明,重组酶TahA的最适作用温度和pH值分别为30℃和4. 5;分别在20～50℃和pH值3. 5～5. 0孵育1 h和2 h后,TahA的相对酶活仍能保持在60%以上; Cu^(2+)、Mn^(2+)和K^+对重组酶的活性有明显的促进作用,而Co^(2+)、Fe^(3+)、Ca^(2+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)、Sn^(2+)、EDTA和SDS对其酶活有不同程度的抑制作用;以没食子酸甲酯为底物时,重组酶的Vmax和Km值分别为0. 436μmol/(mL·min)和5. 143 mmol/L。此外,该重组酶还可以水解茶叶提取物中的酯型儿茶素。这些良好的生化特征为重组单宁酶TahA在茶饮料行业中的应用奠定了坚实的基础。

新疆阿勒泰和温泉县冷水鱼肠道产低温蛋白酶菌株的筛选及其酶学性质的研究

[目的]从50株冷水鱼肠道产蛋白酶菌株中筛选优良产酶菌株,并研究其酶学性质,为高效低温蛋白酶技术的研发奠定基础。[方法]对比脱脂乳平板初筛结果确定供试菌株,对选定菌株进行表型及16S rRNA/26S rRNA序列同源性分析,确定产酶菌株的进化地位。用Folin酚显色法复筛,并研究最佳产酶菌株所产蛋白酶的酶学性质。[结果]从6株供试菌株中筛选出一株高产酶菌株P-D-10,初步鉴定隶属于Pseudomonas。酶学性质的初步研究显示,P-D-10产生的蛋白酶最适反应pH在8.5左右;在0～60℃均有催化活性;具有10和40℃2个最适酶活温度;热稳定性较差,在70℃水浴10 min后剩余酶活力仅为20.14%。除了Tween-80对该酶酶活力有促进作用外,其他金属离子、还原剂、表面活性剂和金属离子螯合剂对该酶酶活力均有不同程度的抑制作用。[结论]筛选获得的高产酶菌株P-D-10隶属于Pseudomonas,是一株具有研究与应用潜力的产低温蛋白酶菌株。

植物三萜皂苷代谢中达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶的生物信息学分析

搜集4种植物的10条达玛烷合成酶及22种植物的30条β-香树脂合成酶,利用生物信息学工具对这2种三萜皂苷代谢关键酶的理化性质、蛋白特性及进化亲缘关系等进行分析。理化性质分析显示,这2种酶的氨基酸序列在氨基酸数目、组成、分子量、理论pI和脂肪指数等方面均表现出较强的一致性;同时,这2种酶的糖基化位点具有高度的保守性,并且大豆(2)、绿玉树、木榄这3条β-香树脂合成酶序列有极大的可能性有糖基化位点;信号肽预测分析表明,这2种酶没有明确的信号肽;α-螺旋和无规则卷曲是多肽链中主要存在的二级结构元件;系统进化树显示序列间差异较小,并且聚类结果与序列的科属特性相一致。不同植物的达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶蛋白特性差别不大,进化距离也比较近,说明这2种酶具有较高的保守性和稳定性。这有助于理解达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶的保守结构域及进化变异,为研究这2种酶的酶学特征及三萜皂苷代谢提供帮助。

非典型腺苷酸激酶AK6/hCINAP的结构和功能

腺苷酸激酶广泛存在于各种生物中,在维持细胞中核苷酸的正常含量以及能量代谢活动中发挥重要作用。腺苷酸激酶6 (AK6,又称人coilin相互作用核ATP酶蛋白hCINAP)是一种非典型的腺苷酸激酶,既具有腺苷酸激酶的活性,又具有ATP酶的活性。本课题组对AK6/hCINAP的结构、酶学特征和生物学功能开展了长期的研究,证明其在调控基因转录、核糖体质量、早期胚胎发育、细胞衰老、细胞代谢、细胞增殖和凋亡、DNA损伤反应、炎症反应、肿瘤发展等诸多生物学过程中均发挥关键作用。本文对AK6/hCINAP的结构特征、生物学功能及上游调控因子进行了总结,阐明该酶生物学作用和分子机制具有重要的生物学意义,有助于开发AK6/hCINAP选择性抑制剂并应用于临床治疗。

漆酶的功能特性与微生物生产研究进展

漆酶是一种多酚氧化酶,分子结构含铜,可以分解生物胺、木质素以及多种酚类物质,在生物检测、食品工业和废水处理等方面都有着广泛的应用价值。本文首先综述了漆酶的酶学特征,并对漆酶的生物功能和应用进行了解释说明,进而分析了产漆酶微生物的种类和酶学性质的差异,最后总结了利用微生物生产漆酶的研究进展,为下一步利用漆酶开展生物修复工程等环保应用的研究奠定了基础。

茶叶中β-葡萄糖苷酶研究进展

对茶叶β-葡萄糖苷酶的分离、纯化、测定方法、酶学特征、基因克隆及其在茶树体内的分布等研究进行了综述,并探讨了今后的研究方向。