重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达

目的构建重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron,并观察其在非小细胞肺癌细胞株PC-9转染后对萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶表达。方法以双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2中的嵌合体内含子(设计长度为133 bp)为模板,PCR扩增后插入到psiCHECK-2质粒中,即获得重组双荧光素酶报告基因质粒psi-CHECK-2-Intron。取psiCHECK-2-Intron质粒,转染至感受态大肠杆菌中,采用琼脂糖凝胶电泳实验观察目的基因片段长度,并对目的基因片段进行基因测序。将重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron、双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2分别转染至PC-9细胞中,记为转染组、对照组,采用qRT-PCR法检测两组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA,采用双荧光素酶活性实验检测两组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性。结果目的基因片段长度为133 bp,基因序列正确,无突变和缺失,表明重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建成功。转染组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA的相对表达量分别为2.213±0.038、2.004±0.025,对照组分别为1.004±0.012、1.003±0.010,两组相比,P均<0.05。转染组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性分别为2.974±0.099、1.948±0.052,对照组分别为1.000±0.018、1.000±0.020,两组相比,P均<0.05。结论成功构建了重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron;psiCHECK-2-Intron转染PC-9细胞后,细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达均升高。

荧光素酶报告基因法测定废气中二噁英类物质

研究二噁英类生物检测法的主要目的是简化二噁英类分析流程,并找出快速检测的结果与HRGC-HRMS(高分辨气相色谱-高分辨质谱)结果之间的换算系数,从而可以利用快速检测的结果和换算系数来推算HRGC-HRMS的结果.介绍了CALUX(荧光素酶报告基因法)分析废气中二噁英类物质的原理,并采用该方法分析了我国27个废气样品,以期找出其测定结果与HRGC-HRMS结果之间的换算系数.结果表明,这2种测试方法数据相关性显著,R2为0.994 8,数据间的换算系数为0.379.试验表明,CALUX法具有很好的推广性,如果再适当增加废气样品的数量,对换算系数进行适当的优化,则所得换算系数可推广.

TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选

目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。

用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向关系

目的:构建长链非编码RNA-H19(lncRNA-H19)萤光素酶报告质粒,利用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)的靶向关系。方法:通过生物信息学网站RegRNA2.0预测获取小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p潜在的互补结合位点。将H19及其突变体克隆到萤光素酶载体psi CHECK-2中,构建H19野生型和突变型质粒,并采用酶切和测序方法鉴定psi CHECK-2-H19载体是否构建成功。将H19野生型和突变型质粒分别与miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p模拟物阴性对照或miR-199a-5p抑制剂阴性对照在293T细胞中共转染。收集细胞后通过双萤光素酶报告系统检测不同组别的萤光素酶活性,从而对lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向调节关系进行验证。结果:构建的重组萤光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确,双萤光素酶报告基因检测显示,与miR-199a-5p模拟物阴性对照组相比,miR-199a-5p模拟物组H19野生型报告基因的萤光素酶活性显著降低,下降约49%左右(P<0.01),而miR-199a-5p抑制剂组H19野生型报告基因的萤光素酶活性较miR-199a-5p模拟物组明显增高(P<0.01)。miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p模拟物阴性对照以及miR-199a-5p抑制剂阴性对照对H19突变型的萤光素酶活性均无明显影响。结论:lncRNA-H19能够靶向结合miR-199a-5p,并在转录后水平对其有直接抑制作用。

一种新型双荧光素酶报告基因表达载体的构建

目的:构建一种新型的双荧光素酶报告基因表达载体。方法:设计并扩增海肾荧光素酶基因hRLUC,将其插入到双酶切的含有萤火虫荧光素酶报告基因(Firefly)的载体pGL4.10中,得到pGL4.10-hRLUC;使用lipofectamine3000将pGL4.10和pGL4.10-hRLUC分别转染入HEK293细胞,检测细胞中荧光素酶活性,以未转染细胞作对照。结果:使用PCR方法获得hRLUC表达单元(2 350 bp);双荧光素酶报告基因表达载体pGL4.10-hRLUC经酶切和测序鉴定,插入正确。转染pGL4.10组荧光素酶活性相对值为(220.311±2.082);转染pGL4.10-hRLUC的细胞中荧光素酶活性低于pGL4.10转染细胞,高于未转染细胞(P<0.05)。结论:成功构建了双荧光素酶报告基因(hRLUC和Firefly)表达载体。

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性。方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性。结论成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础。

B7-H1启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测

目的构建含B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体,转染肝癌Hep G2细胞进行活性检测。方法 PCR扩增B7-H1启动子上游区域基因片段,并插入到含有荧光素酶报告基因的载体PGL3-Basic中构建重组子,经双酶切和测序鉴定后,将重组子转染Hep G2细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶表达活性。结果成功地构建了6种不同长度的PGL3-B7-H1-Luc荧光素酶表达质粒,分别命名为P88、P175、P203、P398、P723和P960。瞬时转染Hep G2后经报告基因检测,P175、P203、P398、P723和P960所含5段启动子均具有转录活性,IFN-γ作用后启动子活性明显增强,而P88转染组IFN-γ作用后,荧光素酶活性无显著变化。结论成功构建了B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体。

人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。

双荧光素酶报告基因系统检测CYP3A4* 1G增强CYP3A4表达的调控作用

目的:探讨CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达的负调控作用。方法:设计合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段(外显子10与内含子10交界处287和181 bp),构建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体,与内参质粒pRL-TK共转染Hep G2细胞,通过双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在287 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=795.575,P<0.001),且G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在181 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=23.218,P<0.001),而G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在CYP3A4内含子10与外显子10交界处CYP3A4*1G存在与CYP3A4*1G变异无关的CYP3A4启动子的抑制元件,该抑制元件对CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达起负调控作用。

Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测

目的:扩增Id1启动子基因,构建Id1启动子的报告基因载体.方法:通过PCR及双酶切方法,从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列;分别克隆到报告基因pGL3-enhancer载体上,构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体;用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系;采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性.结果:经PCR方法扩增出大小分别为1096bp和266bp的两段不同长度的Id1启动子片段,序列测定其编码序列及读框正确,酶切鉴定亚克隆序列正确.瞬时转染HepG2后经报告基因检测,两段启动子均具有转录活性.结论:成功构建了Id1启动子的报告基因载体,为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础.

荧光素酶报告基因在干细胞体内示踪研究中的应用

活体生物发光技术是一种新兴的成像技术．是利用荧光素酶在活体内的可检测性、可视性和持续表达性，以暗视野CCDm（Charge—coupleddevice，电荷偶联设备）相机系统为基础的一种成像技术，它能有效地对报告基因标记的实验对象进行实时、原位的观测，可在完整的体内环境中快速获得时间、空间的信息。生物发光技术具有非侵入性，可以减少实验动物的数量，减少动物个体差异对实验数据的影响.

孕烷X受体应答元件萤光素酶报告基因的构建及活性检测

目的建立孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)应答元件萤光素酶报告基因,并检测其活性。方法利用化学合成方法得到五聚体PXR应答元件(everted repeat elelment-6,ER-6元件)5和(direct repeat element-3,DR-3)5序列;将五聚体PXR应答元件序列(ER6或DR3)克隆至p GL3-Promoter载体上;利用萤光素酶报告基因系统检测PXR应答元件报告基因的活性。结果 PXR应答元件萤光素酶报告基因具有明确的活性。PXR激动剂茴香霉素能够剂量依赖地诱导ER6-Luc(R2=0.95;P=0.002 2)和DR3-Luc(R2=0.96;P=0.000 91)报告基因的活性,其EC50值分别为(0.11±0.04)μmol/L和(0.13±0.06)μmol/L;PXR拮抗剂酮康唑能够剂量依赖地降低茴香霉素诱导的ER6-Luc(R2=0.97;P=0.000 85)和DR3-Luc(R2=0.98;P=0.000 11)的活性,IC50值分别为(0.71±0.11)μmol/L和(1.73±0.15)μmol/L。结论成功构建了PXR应答元件报告基因,建立了PXR转录活性的检测方法。

AP2α荧光素酶报告基因的构建及在BMPs诱导成骨分化研究中的应用

目的构建一种携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体,并应用于筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。方法设计4个串联的AP2α效应元件(AP2α-RE),将其克隆至经Bam HⅠ和MluⅠ双酶切的pBGLuc荧光素酶报告基因质粒构建pBGLuc-AP2α-RE载体。重组腺病毒Ad-AP2α及其两种显性负性突变体Ad-dnAP2α感染小鼠间充质干细胞C3H10,通过Realtime PCR、Western blot检测AP2α的mRNA和蛋白水平表达,EMSA检测AP2α的DNA结合能力。pBGLuc-AP2α-RE转染C3H10细胞,荧光素酶报告基因检测同上各组AP2α的转录活性。Ad-BMPs感染pBGLuc-AP2α-RE转染的C3H10细胞,荧光素酶报告基因筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实AP2α-RE正确克隆至pBGLuc-AP2α-RE荧光素酶报告基因载体,Ad-AP2α感染能显著提高AP2α的表达及结合DNA的能力。显性负性突变体可以表达各自的突变体,EMSA结果显示Ad-dnAP2α-△bHLH组能显著抑制AP2α结合DNA的能力,而Ad-dnAP2α-△TAD组结合的DNA探针强于对照组。荧光素酶报告基因提示AP2α过表达组能促进AP2α转录活性,而两种显性负性突变体均能抑制AP2α转录活性。重组腺病毒BMPs感染组的AP2α转录活性均有增高,其中BMP9最为显著。结论成功构建携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体用于检测AP2α的转录活性,并初步发现BMP9对AP2α的转录活性有明显的促进作用。

利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA

目的建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照pSi-Negative。构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的GFP与萤光素酶基因(LUC)的融合表达载体pGL3-GFPf。将包含3个GFPsiRNA靶序列的GFP片段插入到改建过的pGL3-promoter载体上LUC的3'非翻译区(UTR),构建pGL3-GFPp。将GFPsiRNA表达质粒联同内参照质粒pRL-TK分别与pGL3-GFPf、pGL3-GFPp共转化HEK293细胞。利用双萤光素酶检测试剂盒测定各组细胞中萤光素酶的活力水平,用荧光定量PCR检测各组细胞中GFPmRNA的表达水平。结果同对照组相比,与pGL3-GFPf共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶比值明显降低,其中GFPsiRNA1表达组中降低最显著(P<0.01);定量PCR检测也显示,GFPsiRNA1表达组中GFPmRNA的表达水平降低最明显(P<0.01)。双萤光素酶活性检测和定量PCR结果还显示,与pGL3-GFPp共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中,GFPsiRNA1抑制GFP的表达最显著(P<0.01)。结论本文建立了通过双萤光素酶活性检测来筛选有效的siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案。

双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的调控作用

目的验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3′UTR片段(ARHGAP 29-WT 3′UTR)及突变型3′UTR片段(ARHGAP29-MUT 3′UTR),并将其分别克隆到双荧光素酶报告pmiR-RB-Report载体中,构建双荧光素酶基因报告载体,即野生型载体ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report和突变型载体ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report。将hsa-miR-1291 mimic、阴性对照(non-target control,NC组)同野生型载体、突变型载体载体分别共转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。结果成功构建ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(野生型载体)、ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(突变型载体)。荧光检测结果显示,野生型载体转染hsa-miR-1291 mimic后,其荧光表达较NC组明显下降(0.67±0.04 vs 1.00±0.08,P=0.014);转染hsa-miR-1291 mimic后,突变型载体的荧光表达相对于野生型载体的荧光表达有所上升(1.20±0.05 vs 0.67±0.04,P<0.001)。结论初步证实hsa-miR-1291很可能对ARHGAP 293′UTR上的该位点有靶向调控作用。

Trim5α对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响

目的构建人Trim5α的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim5α,观察其对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响。方法提取Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim5α基因编码区全长片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+),经酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。转染HEK293T细胞,Western blot检测Trim5α蛋白的表达,双萤光素酶报告基因系统检测Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化的影响。结果经鉴定,成功构建Trim5α表达载体,该载体可在HEK293T细胞中表达Trim5α,Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化无显著影响。结论 Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化未见显著影响,初步建立了Trim蛋白对NFκB报告基因影响的功能筛选平台。

大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。

β-防御素-2荧光素酶报告基因载体及克罗恩突变体的构建

目的:构建人β-防御素-2(hBD-2)荧光素酶报告基因质粒及其克罗恩病(Crohns,CD)相关突变体,并检测其在人胚胎肾T细胞(HEK-293T)中的活化.方法:通过基因重组构建包含hBD-2启动子序列的报告基因质粒hBD-2-780-luc,再通过定点突变技术在启动子区(-233位点)引入变异点(G变为C),构建突变体hBD-2-mut-luc;经酶切及测序验证后,将报告基因质粒和野生型NOD2/CARD15蛋白真核表达载体共转染到HEK-293T中,TNF-α刺激后测定双荧光素酶的表达.结果:酶切和测序证实,构建了重组体hBD-2-780-luc及其突变体hBD-2-mut-luc,两者均能表达荧光素酶活性,且明显高于空载体.结论:hBD-2报告基因质粒hBD-2-780-luc及其CD相关突变体hBD-2-mut-luc构建成功,并在细胞内活化表达荧光素酶.

含p21启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p21基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p21启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果表明扩增的p21启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p21报告基因的转录。结论:克隆了p21启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。

催乳素调控序列荧光素酶报告基因的构建

目的通过将人催乳素(hPRL)启动子上游的调控基因(包括启动子,-3518 bp^+15 bp)插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中,构建成含催乳素调控序列的荧光素酶报告基因(PRL3400-pGL3-Basic),用于催乳素在淋巴细胞中的表达调控研究。方法将含hPRL启动子的PGEM-PRL3400,及荧光素酶报告基因pGL3-Basic转染大肠肝菌(JM109)后扩增,提取并纯化PGEM-PRL3400和pGL3-Basic;分别以SacⅠ、BamHI酶切PGEM-PRL3400,SacⅠ、BglⅡ酶切pGL3-Basic;电泳并回收PRL3400片段和pGL3-Basic酶切大片段,在T4 DNA连接酶的作用下,将PRL3400片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中。结果通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒含有pGL3-Basic全序列及催乳素启动子上游调控序列,并且PRL3400片段调控序列的插入位置与方向正确。结论该荧光素酶报告基因构建成功。