Iodogen法碘标记葡萄球菌A蛋白及其亲和层析纯化

Ｉｏｄｏｇｅｎ法碘标记葡萄球菌Ａ蛋白及其亲和层析纯化杨金奎，蒋须勤，张忠邦，陈家伟，郑仕中，邵亚男葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＰＡ）是一种可与人和多种动物ＩｇＧ的ＦＣ片段结合的基因特异性配体，可用来代替ＩｇＧ抗体（第二抗体）．由于ＳＰＡ对ＩｇＧ有广谱结合作用，...

重组溶葡萄球菌酶成品蛋白含量测定方法的建立

重组溶葡萄球菌酶(recombinant lysostaphin,rLysn)对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性,是一种新型抗菌药物,含有该酶的药用制剂在临床上能有效控制金葡菌感染。为在rLysn成品中增加蛋白含量测定以控制制剂的质量,建立了成品中rLysn蛋白含量测定方法,并进行验证。采用体积排阻高效液相色谱法(size exclusion high performance liquid chromatograph,SEHPLC)测定rLysn理化对照品及成品蛋白质含量。色谱柱:TSK gel 2000SWXL(7.8 mm×30 cm,5μm);流动相:20 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)+0.3 mol/L NaCl;流速:0.5 mL/min;柱温:25℃;检测波长:280 nm。结果显示,rLysn在2-32μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r2=1);低、中、高3种浓度的rLysn理化对照品空白加标平均回收率为102.9%,成品加标平均回收率为102.1%;3种不同上样量在不同时间内测定,蛋白含量RSD<1%;每隔1 h测定同一支供试品溶液,蛋白含量RSD为0.98%;同一批供试品溶液取6份进样,蛋白含量RSD为1.71%。实验结果表明,采用SE-HPLC方法简便,准确性、精密度、稳定性及重复性好,可用于rLysn成品蛋白质含量的测定。

凝固酶阴性葡萄球菌的青霉素结合蛋白产生和苯唑西林MIC相关性研究

目的分析凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的产生和苯唑西林MIC相关性。方法收集82株临床分离株,采用MRSA胶乳凝集法、MIC法分别检测CNS对苯唑西林的耐药性,比较各试验结果。结果苯唑西林MIC≥0.5mg/L或产生PBP2a的表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌均能正确地表示苯唑西林耐药;苯唑西林MIC≥0.5mg/L解释标准对头葡萄球菌、腐生葡萄球菌、人葡萄球菌、模仿葡萄球菌等CNS评价苯唑西林为耐药,正确性很低,有80.0%未产生PBP2a的菌苯唑西林MIC≥0.5mg/L,使这些菌被错误地报道苯唑西林耐药。结论新的苯唑西林解释标准对产生PBP2a的CNS均能正确地评价,而对未产生PBP2a的CNS某些菌种缺乏特异性;MRSA胶乳凝集试剂盒可快速、准确地检测耐苯唑西林的CNS。

鉴定金黄色葡萄球菌的凝固酶和A蛋白双标记胶乳试剂的研制和应用

研制了鉴定金黄色葡萄球菌的丙种球蛋白和血浆纤维蛋白原双重标记的胶乳试剂。检测临床标本分离的葡萄球菌295株,结果表明该胶乳试剂提高了金葡菌的检出率,且较简便快速。

溶纤法测定^(125)I标记基因重组葡萄球菌激酶的活性

目的测定125I标记前后的基因重组葡萄球菌激酶(rSak)活性。方法采用抑菌圈原理,建立纤维蛋白平板溶纤法。结果在0.625～10mg·L-1浓度范围线性良好(r=0.997),125I标记后rSak为标记前的81.1%。结论该方法简便准确,操作方便。

酶标葡萄球菌A蛋白组化法在流行性出血热诊断上的应用

使用辣根过氧化酶标记葡萄球菌A蛋白(HRP—SPA)间接免疫酶组化法检测100例流行性出血热病人、54例非出血热病人及31名正常人血清中出血热异特性抗体。结果表明(HRP—SPA)在灵敏度和特异度上与间接免疫荧光法IFA基本相同,由于HRP—SPA简便易行,可作为EHF诊断的一种新方法。

重组溶葡萄球菌酶中宿主菌残余蛋白含量的测定

制备球形芽孢杆菌菌体蛋白作为免疫抗原,免疫家兔制备抗血清,建立了一种测定重组溶葡萄球菌酶中残余宿主菌菌体蛋白含量的双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA法快速、简便、灵敏,检测范围宽,能检测出制品中的微量菌体蛋白;对3批重组溶葡萄球菌酶原液的检测合格,制品中残余宿主菌蛋白含量小于万分之二。此方法可以用于重组溶葡萄球菌酶中残余宿主菌菌体蛋白含量的测定。

A蛋白与凝固酶凝集试验在金黄色葡萄球菌快速鉴定中的应用

目的探讨金黄色葡萄球菌快速检测的可能性。方法用凝固酶(CA)(试管法和玻片法)和葡萄球菌A蛋白(SPA)两种方法检测667株葡萄球菌。结果378株金黄色葡萄球菌中二者同时呈阳性的有303株,阳性率为80.2%,特异性、准确性均为100%;CA与SPA试验联合使用的阳性率之和高至98.9%,而其他289株葡萄球菌CA与SPA试验的阳性率之和仅为12.4%。结论CA与SPA试验联合运用对金黄色葡萄球菌的鉴定具有快速、准确、简便易行及特异性强等优点。

金黄色葡萄球菌脱水鲨烯脱氢酶(CrtN)和DNA结合蛋白Sso7d的融合表达

分子质量相对小的DNA结合蛋白Sso7d可以帮助蛋白折叠,提高蛋白表达量并有助于晶体生长.为解决金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)脱水鲨烯脱氢酶(dehydrosqualene desaturase,Crt N)蛋白较难在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶表达的问题,借助小分子DNA结合蛋白Sso7d,将其与Crt N基因通过重叠PCR(Overlapping PCR)连接起来,连至p ET-46 Ek/LIC载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行带有6-His标签的融合表达.通过核酸电泳及序列测定进而确定所连接基因的正确性,经Ni-NTA亲和层析与凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)对目的蛋白进行确证.通过对Crt N-Sso7d以及Sso7d-Crt N进行分析比较,发现Crt N-Sso7d的表达量较高且能得到较多高纯度蛋白,这将被用来进行后续蛋白结晶和结构解析工作.

用异硫氰酸荧光素标记葡萄球菌A蛋白检测抗核抗体

旨在建立一种血清抗核抗体检测的新方法.首先以异硫氰酸荧光素标记葡萄球菌A蛋白,将冰冻于燥的葡葡球菌A蛋白溶解于缓冲液中,4℃磁力搅拌下逐滴加入异硫氰酸荧光素,并持续搅拌24h,然后SepheadexG25柱层析一次.得到异硫氰酸荧光素标记葡萄球菌A蛋白试剂.

邻近标记技术在膜蛋白相互作用中的研究进展

膜蛋白是细胞多种生命活动的主要承担者,膜蛋白之间的相互作用参与调控细胞间的接触与信号传递,并与细胞的分化、成熟息息相关。因此,开发多种深入解析膜蛋白之间相互作用的方法具有重要的理论与现实意义。除了传统的免疫共沉淀方法之外,新开发的邻近标记技术已经逐渐成为了研究膜蛋白相互作用的重要手段。邻近标记技术主要利用生物工具酶标记与诱饵蛋白相互作用的邻近蛋白,并通过流式细胞术、质谱以及共聚焦显微成像技术等方法检测膜蛋白之间的相互作用。本文着重介绍了近些年来新开发的用于研究膜蛋白相互作用的多种邻近标记技术,并展望了该类技术在膜蛋白相互作用领域未来的发展前景。

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体裂解酶LysIMEP5基因的克隆及序列分析

为了克隆奶牛乳房炎金黄色(葡萄球菌裂解性噬菌体裂解酶Lys IMEP5基因,分析其生物信息学特性,以本实验室分离的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体v B_Sau S_IMEP5为材料,根据其全基因组学信息,获取裂解酶基因序列,应用Primer 5.0设计特异性引物。采用PCR方法扩增并克隆Lys IMEP5基因,通过BLAST进行序列比对分析,利用在线软件对蛋白结构进行预测。成功克隆到裂解酶Lys IMEP5基因,测序结果通过DNAMAN比对与原序列完全匹配,无任何基因突变,同源性分析显示,与已报道的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶相似性最高为83.1%;裂解酶Lys IMEP5基因序列全长1371 bp,共编码456个氨基酸,为亲水性蛋白,分子质量为51.717 k Da,理论等电点为9.70;Lys IMEP5同时存在CHAP片段和Amidase-3片段;该蛋白无跨膜区,无信号肽,以无规则卷曲为主。从奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体中成功克隆出Lys IMEP5基因,通过对该蛋白的结构预测分析为后续克隆表达及开发新型绿色抑菌剂奠定了基础。

金黄色葡萄球菌表面烯醇化酶的研究进展

金黄色葡萄球菌是人和动物重要致病菌,常引起肺炎、脑膜炎、败血症、食物中毒等多种疾病。目前的研究发现,金黄色葡萄球菌有许多致病机理,因此迫切需要寻找一种替代预防或治疗金黄色葡萄球菌的试剂。近年来,人们对金黄色葡萄球菌表面烯醇化酶参与侵染过程的研究日益重视。烯醇化酶可以作为纤溶酶原和层黏连蛋白来调节细菌黏附和侵袭作用。文章就金黄色葡萄球菌表面烯醇化酶的研究进展做一简单的综述。

4类葡萄球菌肠毒素的3种放大酶联免疫吸附测定技术的研究

葡萄球菌肠毒素是引起食物中毒的主要致病蛋白质之一。目前由于对各类毒素检查方法的敏感性不太高(ELISA在1～10ng/ml),常常造成漏检。国内仅1篇文献报告采用BA-ELISA测定SEB的最低下限为0.38～1.5ng/ml,去年日本学者报道用BA-ELISA测定TSST的敏感性限30pg/ml。为了进一步提高对各类SE检测的敏感度,我们使用自制的兔抗SEA。

聚苯乙烯肽亲合标签和葡萄球菌蛋白A免疫球蛋白Fc结合区融合蛋白的克隆表达与应用

目的应用生物工程技术克隆、表达聚苯乙烯肽(PS)亲和标签(PStag)和葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫球蛋白(IgG)-Fc结合区(ZZ)融合蛋白,在大肠埃希菌BL21中进行高效表达并初步纯化,为优化、提升免疫检测方法奠定基础。方法应用基因合成技术串联SPA-ZZ结构域和PStag基因,构建重组表达质粒pPS-SPA,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫转印试验(Western blot)鉴定表达和纯化产物;直接酶联免疫吸附试验(ELISA)验证融合表达产物对亲水ELISA板的表面吸附特性和定向结合兔、鼠IgG-Fc区的效果。结果在合成基因的基础上构建的表达载体经序列分析与限制性酶切证实了串联基因的正确克隆,PAGE结果表明可诱导高表达PStag-SPA,纯化产物对亲水ELISA板的吸附能力较高,表达产物对兔与鼠IgG具有定向吸附能力。结论重组表达的PStag-SPA具有对ELISA板的黏着能力和定向结合兔、鼠IgG-Fc的应用潜力,为优化酶免疫检测技术提供了技术支持。

邻近标记技术在蛋白质-蛋白质相互作用中的研究进展

蛋白邻近标记(proximity labeling,PL)技术是指通过融合特定的催化酶,实现对目标蛋白相互作用蛋白的原位标记,再采用质谱或测序分析鉴定标记蛋白。该技术能够在瞬时动态条件下精确识别蛋白质相互作用,是传统分析手段的重要补充,在蛋白质相互作用研究中具有广阔应用前景。本文介绍了各类PL酶的工作原理、分类及优缺点;论述了该技术在研究蛋白质与蛋白质相互作用中的应用;讨论了PL技术的优势、目前存在的问题和发展趋势,以期为该技术的应用提供参考。

不同来源血浆对试管法葡萄球菌凝固酶试验的影响

目的探讨试管法葡萄球菌凝固酶试验的最佳血浆及试验持续观察时间并解决假阴性问题,减少其检测的漏检率。方法用枸橼酸钠稀释不同的献血员及普通患者血浆对标准金黄色葡萄球菌菌株进行血浆凝固酶试验。结果分别用献血员、普通患者血浆做此试验在4 h、24 h、36 h观察凝固情况,以献血员血浆较普通患者血浆阳性率较高、假阴性率较低,并且36 h结果阳性率最高、假阴性率最低。结论采用不同来源血浆直接影响试管法血浆凝固酶试验的诊断效率,采用献血员血浆明显优于普通患者血浆。