高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型的建立及其在药物肝毒性评价中的应用

目的建立一种灵敏、快速的高细胞色素P450(CYPs)酶活性的大鼠原代肝细胞模型,用于评价经CYPs酶代谢后产生肝毒性的药物。方法分别采用苯巴比妥和β-萘黄酮两种CYPs酶广谱诱导剂构建大鼠原代肝细胞模型;应用"cocktail"探针底物法考察两种诱导剂对CYPs酶的影响;以基于CYPs酶代谢导致肝毒性的药物他克林(TAC)、双氯芬酸钠(DIC)和对乙酰氨基酚(PAR)为模型药物,评价所构建的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型与普通大鼠原代肝细胞间灵敏性的差异;应用所构建的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型评价维拉帕米(VER)的肝毒性。结果与普通大鼠原代肝细胞相比,3种模型药物在高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞中,在较低剂量时可使细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、细胞中活性氧(ROS)水平升高,线粒体膜电位(MMP)水平下降,或相同剂量下得到更严重的损伤结果,CYPs酶抑制剂1-aminobenzotriazole(ABT)和metyrapone(MET)能抑制这3种损伤的发生;100μmol/L维拉帕米在普通大鼠原代肝细胞中并未引起LDH、ROS和MMP的改变,但在高CYPs活性大鼠原代肝细胞模型中,会引起细胞损伤,ABT和MET能抑制这种损伤。结论经诱导建立的两种高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型能更灵敏的评价基于CYPs酶代谢致毒药物的肝毒性;两种诱导剂诱导得到的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型对经不同CYPs酶亚型代谢的药物评价结果有各自优势。应用高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型证实维拉帕米的致毒机制是经CYPs酶代谢产生肝毒性。

薄荷油对大鼠肝组织GSH、ATP酶和原代肝细胞的影响

目的:研究薄荷油对大鼠肝组织GSH、ATP酶和原代肝细胞的影响。方法:大鼠口服24%薄荷油,36 h和48 h后取肝组织,检测GSH含量以及Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力。分离培养原代大鼠肝细胞,加入薄荷油或其含药血清共同孵育,分别于12 h、24 h、48 h时检测上清液中LDH、ALT、AST水平。结果:肝组织GSH含量显著降低,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明显降低(P<0.05或P<0.01)。薄荷油0.5μL/mL、5μL/mL和10%薄荷油含药血清均可导致肝细胞上清液中LDH、ALT、AST水平不同程度的升高(P<0.05或P<0.01),在24 h最为显著,与四氯化碳引起的损害相似。结论:薄荷油口服能被机体吸收并直接对肝细胞产生损伤,其损伤途径可能与氧化应激反应有关。

微囊藻提取物对大鼠原代培养的肝细胞酶学和形态学影响研究

目的 深入探讨以微囊藻毒素 (MC)为代表的蓝藻提取物对肝脏的毒性作用特征及其机制。方法 采用不同剂量的蓝藻提取物染毒原代培养的大鼠肝细胞 ,观察由此所致的细胞酶学和形态学变化。结果 当微囊藻毒素含量为0 .1、1、10 μg/ ml时 ,肝细胞培养液中乳酸脱氢酶 (L DH)、谷草转氨酶 (AST)含量增加 ,碱性磷酸酶 (AKP)、γ-谷氨酰转移酶 (GGT)、谷丙转氨酶 (AL T)和谷胱甘肽 (GSH)尚未见明显变化。染毒后的肝细胞增生活跃 ,并伴有凋亡或坏死样表现 ,扫描电镜显示染毒后的肝细胞变得不规则 ,呈空洞样变并有特征性的胞膜疱出现 ,与培养细胞所表现的膜损伤相一致。

皮质酮对大鼠再生肝细胞鸟氨酸脱羧酶活性及其基因表达的影响

采用高效液相色谱和原位杂交技术研究了皮质酮对大鼠再生肝细胞鸟氨酸脱羧酶 (ODC)活性及ODCmRNA表达的影响。结果显示 ,大鼠完整肝脏中ODC水平较低 ,2 / 3肝切除 (PH)后 3h ,不同处理组ODC活性开始升高 ,6h达到最高值 ,其中 ,去肾上腺 +NaCl组和糖皮质激素受体拮抗剂RU4 86处理组的酶活性高于对照组 (去肾上腺假手术组 ) ,而去肾上腺 +皮质酮处理组的酶活性低于对照组 ,36h恢复到肝切除前水平 ;完整肝脏的ODCmRNA水平极低 ,PH后表达量迅速增加 ,5h达到最大值 ,不同处理组mRNA水平的高低顺序与酶活性一致 ,12h降至肝切除前水平 ;在PH前 12h给大鼠注射RU4 86 (10mg/kg体重 ) ,取得了与去肾上腺 +NaCl处理鼠相似的结果。以上结果表明 ,在PH诱导的再生肝细胞中 ,ODCmRNA表达量的增加和 /或减少是造成ODC活性改变的原因之一 ,皮质酮对ODC活性及其mRNA的表达具有抑制作用 ,主要表现在肝再生的早期 。

塞曼特罗（Cimaterol）对大鼠肝细胞氮代谢及6—磷酸葡萄糖脱氢酶活性的影响

利用原代肝细胞培养技术测定了塞曼特罗(Cimaterol,CIM,1×10-mo1)对大鼠肝细胞氮代谢和6磷酸葡萄糖脱氢酶((G 6-PDH)活性的影响.结果表明,CIM可影响大鼠肝细胞中尿素氯的浓度,与对照组相比,CIM试验组培养液中尿素氮水平下降了23.87%(P<0.05),且CIM的这种作用可被β-受体阻断刺心得安(PRO,1×10-6mol)所阻断.CIM也可增加3H-亮氨酸掺入肝细胞的量,与对照组相比,其幅度提高了19.77%(P<0.05);同样,PRO可抑制这种作用.CIM还具有增加大鼠肝细胞产生IGF-I的趋势,但与对照组相比无明显影响(P>0.05).CIM对大鼠肝细胞G 6-PDH活性有显著影响,试验组肝细胞中G-6-PDH活性与对照组相比下降了43.36%(P<0.05);CIM引起的肝细胞G-6-PDH活性下降的作用也可被PRO所阻断.结果提示,CIM可通过增强大鼠肝细胞氮素的保留和蛋白质的合成,以及通过抑制肝细胞G-6-PDH活性,影响脂肪代谢,从而调节机体的生长发育.

生长因子对大鼠肝细胞增殖和酶活性表达的影响

目的研究表皮生长因子 (EGF)、肝细胞生长因子 (HGF)、EGF联合HGF对大鼠原代培养肝细胞增殖和功能的影响 ,为肝细胞移植建立细胞库、提高逆转录病毒载体感染肝细胞的效率寻找适当的培养条件。 方法分离、培养肝细胞 ,采用3 H -TdR掺入试验测定肝细胞内DNA合成 ,应用细胞化学方法观察培养的肝细胞内葡萄糖 -6 -磷酸酶活性的表达。 结果培养肝细胞受EGF(1 0ng/ml)、HGF(5ng/ml)作用后 ,肝细胞内DNA合成分别增加了 5 9倍 (P <0 .0 1 )和 1 6倍 (P <0 .0 1 )。EGF和HGF联合应用不表现出明显的协同作用。培养的肝细胞可合成葡萄糖 - 6 -磷酸酶 ,具有肝细胞特异性功能。 结论提示EGF和HGF在体外可刺激肝细胞增殖并维持肝细胞功能 ,为肝细胞移植、肝病基因治疗提供了一个完善的肝细胞培养系统。

不同氧浓度下大鼠肝细胞有氧代谢酶CCO、PDH、KGDH活性的实验研究

目的 观察缺氧对肝脏实质细胞糖有氧氧化的影响。方法 利用体外培养的肝细胞缺氧模型 ,模拟创伤后的缺血、缺氧状态 ,以正常培养的大鼠肝细胞为对照 ,采用生物化学的方法 ,分析不同氧浓度及缺氧时间下肝细胞有氧氧化关键酶活性的变化 ,并测定了细胞内ATP含量的变化。结果 与正常对照组相比 ,缺氧肝细胞内丙酮酸脱氢酶 (PDH)、α 酮戊二酸脱氢酶 (KGDH)、细胞色素C氧化酶 (CCO)活性在缺氧培养 1h即显著降低 ,并持续到 16h ;缺氧时肝细胞内ATP含量随时间延长而下降 ,4h达到最低。

大鼠肝实质细胞原代培养模型的研究及其功能鉴定

目的:为肝细胞功能及相关的研究提供一种客观的、简便的大鼠肝细胞原代培养模型,并鉴定肝细胞的功能.方法:在传统的两步灌流法的基础上进行改良分离培养肝实质细胞;流式细胞术测定原代肝细胞的细胞周期和细胞凋亡情况;SRB法测定不同培养基对原代肝细胞的生长和功能的影响.结果:分离得到的肝细胞成活率可达90%以上,纯度可达95%以上;流式细胞术结果表明原代肝细胞大多处于G0/G1期,且基本无凋亡;SRB法和白蛋白分泌量检测结果显示,低糖DMEM组原代肝细胞生长和白蛋白分泌功能在短期内(1～5 d)与高糖DMEM组没有明显差异;RPMI1640组肝细胞的生长和功能则明显低于前两组(P＜0.05).结论:体外培养的肝细胞活力和纯度均较高,体外培养后细胞功能正常,是一种实用的体外研究肝细胞良好的细胞学模型.

赤豆荚果总黄酮提取物对原代培养大鼠肝细胞氧化损伤的保护作用

目的:探讨赤豆荚果总黄酮提取物抗氧化作用以及对培养大鼠原代肝细胞氧化损伤的保护作用。方法:采用Photochem抗氧化测定仪对赤豆荚果总黄酮提取物体外抗氧化作用进行评价,同时评价其对培养大鼠原代肝细胞Fe2+氧化损伤保护作用的量效、时效关系。结果:赤豆荚果总黄酮提取物具有较强的抗氧化作用,在40,80,120ng剂量下,抗氧化作用大于芹菜素(P<0.05)。培养的原代肝细胞中加入100 μmol/L Fe2+后肝细胞活性减弱,培养液中ALT活力升高(P<0.05),脱落明显。加入提取物后,可有效抑制上述损伤作用。论:赤豆荚果总黄酮提取物具有较强的体外抗氧化作用,对Fe2+导致的大鼠原代肝细胞氧化损伤具有保护作用。

蛹虫草多糖对四氯化碳诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用研究

蛹虫草是一种药用真菌。从人工培养的蛹虫草中提取蛹虫草多糖(CMPS),采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,研究蛹虫草多糖对CCl4诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用。结果表明:蛹虫草的子实体和基质都含有丰富的多糖,其中基质中的多糖含量最高,约为子实体的2～4倍;CMPS可明显降低由CCl4诱导的损伤肝细胞培养上清液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的活性水平和丙二醛(MDA)的含量水平,显著提高由CCl4诱导的损伤肝细胞培养上清液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和诱导损伤肝细胞的存活率。试验结果提示CMPS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。

大黄素对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用

大黄素（emodin,EMD）为蒽衍生物中分布最广泛的单蒽核类1,8-二羟基蒽醌衍生物,是许多中药尤其是蓼科植物虎杖、大黄、何首乌等的主要有效成分,因此含有该类药材的中成药多以 EMD 作为质控指标,在质量标准和生产工艺研究中具有重要价值。近年来的研究表明,EMD 具有多种药理作用,包括抑制肿瘤、抗病毒、抗氧化及免疫抑制等。曾有报道认为 EMD对 CCl4和 D-氨基半乳糖造成的试验动物肝损害有保护作用,但从细胞水平研究其保护作用,目前国内外尚无文献报道。本研究以 CCl4体外损伤的原代培养大鼠肝细胞为实验模型,通过测定培养液中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）。

氟对原代培养大鼠肝细胞的氧化损伤作用研究

目的探讨氟对原代培养大鼠肝细胞的氧化损伤作用。方法采用半原位酶消化法分离大鼠肝细胞,氟化物染毒24h后用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,检测培养液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量。结果氟对大鼠肝细胞具有明显的毒性作用,表现为细胞存活率下降,ALT、AST的活性升高,MDA含量增加。结论脂质过氧化引起的氧化损伤作用是氟致原代培养大鼠肝细胞毒性的主要原因。

大鼠实验性疲劳对肝脏结构及酶活性的影响

大鼠实验性疲劳对肝脏结构及酶活性的影响成都体育学院黎锦，殷劲运动疲劳是运动医学研究的重要内容。多年来，国内外学者对它进行了广泛和深入的研究，但纵观这些疲劳理论，发现多集中于中枢神经系统和外周肌肉（１），而对内脏实质器官的研究却相对较少，尤其是运动疲劳...

激烈运动对小白鼠肝细胞中琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶活性的影响

为进一步探讨体育运动对人体各器官的结构、生理功能、生化变化的影响,为填补运动解剖学教材中运动对肝细胞影响这一空白,提供一点形态学依据,因此我们设计了川组织化学中酶学的方法,观察小白鼠15分钟激烈运动后,肝细胞中琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶活性的变化。近年来,对运动员的血液和骨骼肌中这两种酶活性的研究较多,公认的是SDH(琥珀酸脱氢酶)活性的高低代表着肌纤维中氧化能力的高低;LDH(乳酸脱氢酶)标志着肌纤维中糖元无氧酵解的能力;ATP(三磷酸腺苷酶)和CPK(磷酸肌酸激酶)与肌纤维收缩有关等。

不同急性肺损伤大鼠模型Na^+-K^+-ATP酶活性变化及对地塞米松的反应

目的探讨肺泡上皮细胞膜上Na+-K+-ATP酶在盐酸(HCl)和脂多糖(LPS)两种原因致急性肺损伤大鼠肺水生成中的作用及地塞米松(Dex)治疗肺水肿的意义。方法96只雄性SD大鼠随机分为6组(每组16只):生理盐水对照组(NS组)、NS+Dex组、HCl模型组、HCl+Dex组、LPS模型组、LPS+Dex组,每组又分为支气管肺泡灌洗(BAL)亚组和非支气管肺泡灌洗(NBAL)亚组。NBAL组观察肺组织病理改变、湿干重比(W/D)、Na+-K+-ATP酶水解活性和哇巴因与其受体Na+-K+-ATP酶特异性结合位点数量的变化;BAL组观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞数及蛋白含量的变化。结果①两种模型组Na+-K+-ATP酶水解活性和酶位点数在激素干预前均显著低于干预后水平,并且显著低于对照组水平。②激素干预前两种模型组BALF中细胞总数、PMN分类计数、蛋白含量显著高于干预后水平,显著低于对照组水平。结论Na+-K+-ATP酶在肺水的转运中起重要作用,ALI时肺泡膜上Na+-K+-ATP酶的活性降低可能是产生肺水肿的重要机制之一,地塞米松可以分别增加两种模型组Na+-K+-ATP酶水解活性和位点数;地塞米松可以减轻LPS组肺水肿(以W/D表示)的程度,但对HCl组无效。

DMN诱发大鼠肝硬化模型MMP-2活性的动态变化

目的:探讨二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine,DMN)诱发大鼠肝硬化过程中Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶(MMP-2)活性及基质金属蛋白酶抑制物-2(TIMP-2)表达的动态变化.方法:采用DMN诱发大鼠肝硬化模型,设2d,1,2,3,4,5,6,8,12,24wk共10个观察点,分别用生化方法测定其肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量、血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)活性和白蛋白(albumin,ALB)含量,Envision两步法(免疫组化)测定肝组织Ⅳ型胶原和TIMP-2表达,酶图法测定肝组织MMP-2活性.结果:模型大鼠肝组织Hyp、Ⅳ型胶原含量,血清ALT活性显著高于正常组,ALB含量显著低于正常组.2d时MMP-2活性显著高于正常组,然后在正常范围内波动.正常组和8wk以前各组模型大鼠TIMP-2表达微弱,12wk表达明确,24wk表达增强.结论:DMN诱发Wistar大鼠肝硬化模型形成前后MMP-2功能主要通过蛋白分泌量和活化量调节而实现,此期肝窦基底膜Ⅳ型胶原含量主要通过MMP-2活性调节,和蛋白分泌及TIMP-2表达关系不大.在肝硬化恢复期TIMP-2调节的重要性逐渐上升,故TIMP-2表达量是肝硬化时肝窦毛细血管化能否恢复的关键因素之一.