“Yolk-shell”结构中高效双酶级联催化体系的构筑

合成了一种生物-无机杂化材料ZIF-8@GOx-CPO@ZIF-8,该材料以具有“蛋黄-壳(Yolk-shell)”结构的金属有机框架(MOF)为载体,将葡萄糖氧化酶(GOx)和氯过氧化物酶(CPO)封装在不同隔离空间中构建了双酶纳米反应器.“Yolk-shell”结构可为封装的酶提供纳米邻近效应,GOx催化底物原位生成的H_(2)O_(2)可启动相邻的CPO催化反应,有效减少了反应物的扩散阻力和H_(2)O_(2)的分解和逃逸,同时避免了两种酶催化反应的相互影响.与均相缓冲液中的游离酶相比,ZIF-8@GOx-CPO@ZIF-8的级联催化效率更高.由于MOF的屏蔽效应,酶的热稳定性和有机溶剂耐受性显著提高.“Yolk-shell”结构还可有效抑制材料重复使用过程中酶分子的泄漏,经过20次重复使用后,ZIF-8@GOx-CPO@ZIF-8仍可保持初始级联催化效率的72%.将ZIF-8@GOx-CPO@ZIF-8双酶级联反应生成的HClO应用于偶氮染料的高效脱色和水果保鲜.在1 mg/mL ZIF-8@GOx-CPO@ZIF-8水溶液中,橙黄G(0.3 mmol/L)在15 min内可完成脱色(脱色率>98%).在新鲜草莓的杀菌保鲜实验中,ZIF-8@GOx-CPO@ZIF-8也显示出良好效果.ZIF-8@GOx-CPO@ZIF-8双酶级联催化体系具有高效、稳定、温和及绿色的特点,极具应用潜力.

丝状自组装蛋白支架介导的双酶级联催化体系构建促进D-塔格糖合成

D-塔格糖是一种稀有的己酮糖,具有低能量、高甜度,在食品领域具有广泛的应用。目前,D-塔格糖的生物合成大多聚焦于异构酶途径及关键酶L-阿拉伯糖异构酶的挖掘与改造,多酶级联催化的应用较少,且受热力学平衡影响转化率较低。该研究首先构建并表征了来源于Methanocaldococcus jannaschii的丝状自组装蛋白支架EE/KK,结果显示,其在胞内外均可实现有效的荧光蛋白级联互作。其次,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中应用EE/KK蛋白支架级联组装D-木糖还原酶(SsXR,Scheffersomyces stipitis来源的NAD(P)H-dependent D-xylose Reductase)和半乳糖醇脱氢酶(RlGDH,Rhizobium leguminosarum来源的SDR Family Oxidoreductase),强化基于氧化还原酶途径合成D-塔格糖的效率。相较于游离体系,EE/KK级联体系的D-塔格糖产量提高50%。进一步对级联体系重组菌株BL21-EX/KG(EX和KG分别为EE-SsXR和KK-RlGDH蛋白复合体的缩写)发酵条件进行优化,结果表明:以Luria-Bertani(LB)培养基为发酵培养基,温度20℃,0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside,IPTG)下,以10 g/L乳糖为底物,D-塔格糖产量可达3.93 g/L,对乳糖转化率为0.39 g/g,为理论转化率(0.53 g/g)的74%,高于大多数以乳糖为底物合成D-塔格糖的报道。该研究为D-塔格糖生物合成提供潜在的高效菌株以及多酶级联组装提供有效的工具。

光酶级联一锅法合成手性脂肪胺

对映体脂肪胺在有机合成与化工领域具有广泛的应用,但其主要依赖于金属催化获得.我们设计了一种光催化与酶催化级联催化的合成方法,由脂肪醇出发合成手性脂肪胺.通过筛选,发现9-芴酮在可见光激发下可高效催化脂肪醇氧化为脂肪酮,后者作为反应中间体被转氨酶在胺供体存在下经转氨反应合成手性胺.在一锅法条件下,该级联方法转化率可达99%,目标产物的光学纯度>99%.此外,该光催化体系可分别与手性互补的转氨酶级联,进而获得手性反转的脂肪胺产物.该光酶级联催化方法充分结合了光催化的高效率与酶催化的立体选择性优势,为手性脂肪胺类分子的合成提供了一种新型合成方法.

基于Hg_(2)[Fe(CN)_(6)]纳米酶的多功能酶级联传感体系检测葡萄糖和酸性磷酸酶

该文基于Hg^(2+)可与K_( 4)[Fe(CN)_(6)]原位反应形成Hg_(2)[Fe(CN)_(6)]纳米酶的机理,并利用过氧化氢(H_(2)O_(2))可激发Hg_(2)[Fe(CN)_(6)]酶活性,以及焦磷酸盐(PPi)可通过与Hg^(2+)结合阻止Hg_(2)[Fe(CN)_(6)]纳米酶的形成的原理,构建了多功能酶级联传感平台。当葡萄糖存在时,葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H_(2)O_(2),Hg_(2)[Fe(CN)_(6)]催化H_(2)O_(2)分解产生的羟基自由基(·OH)可氧化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色,从而实现葡萄糖的检测。该方法对葡萄糖检测的线性范围为0.10~500μmol/L,检出限为30 nmol/L。当酸性磷酸酶(ACP)存在时,ACP可以水解PPi并释放出与PPi结合的Hg^(2+),Hg^(2+)与K_( 4)[Fe(CN)_(6)]原位反应生成Hg_(2)[Fe(CN)_(6)]纳米酶,进而可实现ACP的检测。结果表明,该方法对ACP检测的线性范围为0.03~50 U/L,检出限为0.0070 U/L。该传感平台操作简单、灵敏度高,为多功能传感体系的设计提供了一种新的思路。

双酶级联生物合成D-赖氨酸

建立了氨基酸消旋酶和赖氨酸脱羧酶双酶级联高效生产D-赖氨酸的方法。利用氨基酸消旋酶全细胞催化消旋L-赖氨酸得到DL-赖氨酸,去除氨基酸消旋酶后再加入赖氨酸脱羧酶,将消旋产物中的L-构型脱羧生成1,5-戊二胺和CO2,剩下D-赖氨酸;最终,通过阳离子交换树脂吸附洗脱得到D-赖氨酸。经考察双酶级联催化的最佳条件为:反应温度40℃,0.2 mol/L磷酸钾缓冲溶液(p H=5.8),底物L-赖氨酸质量浓度为50 g/L,氨基酸消旋酶全细胞和赖氨酸脱羧酶全细胞质量浓度均为10 g/L,4 mmol/L磷酸吡哆醛,0.1 g/L Triton X-100,反应时间12 h,其中消旋反应2 h和脱羧反应10 h,最终D-赖氨酸收率达42%,对映体过量值(e.e.值)=98%。

多酶级联催化合成(R)-β-酪氨酸

目前报道的β-酪氨酸生产方法需要较为复杂的底物而且大多依赖于贵金属催化剂。为了实现生物法绿色合成β-酪氨酸,通过人工设计的级联反应,将酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸氨基变位酶进行级联,以苯酚、丙酮酸和铵盐等廉价化合物为底物合成(R)-β-酪氨酸。通过基因挖掘筛选了所需的酶元件,并采用蛋白质工程改造,提升了限速酶的催化效率。在大肠杆菌宿主中对所筛选的酶进行共同表达,经优化获得了(R)-β-酪氨酸合成菌株E.coli S10。在1 L规模反应中,菌株E.coli S10合成(R)-β-酪氨酸的转化率达到78%,ee值>99%。利用高分辨质谱(HRMS)和核磁共振图谱(NMR)分别鉴定了纯化产物的分子量和结构,结果表明通过该级联路径可成功合成目标产物(R)-β-酪氨酸。研究工作可为(R)-β-酪氨酸的绿色酶法生产提供理论指导。

体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M

为建立体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M(Rebaudioside M,RM),该文分别构建了含有甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1和水稻来源的糖基转移酶EUGT11以及拟南芥来源的蔗糖合成酶SUS1的重组大肠杆菌,将甜菊苷经一锅法催化合成RM。为提升该体系中限速酶EUGT11的酶活,从而提升整个体外多酶级联反应体系的RM产量,本文将该酶表达质粒的T7启动子核心区域串联,并比较一重、二重、三重和四重启动子启动转录时该酶活性,当三重启动子启动转录时,重组酶EUGT11的酶活力最高,是一重启动子启动转录时的2.13倍,在酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39的体外多酶级联反应体系中,RM产量为3.79 mmol/L,较酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3的体外多酶级联反应体系中,RM的产量提升了2.35倍。该文成功建立了高效合成RM的体外多酶级联反应体系,为此后工业化酶法合成RM提供理论和数据支持。

多酶级联系统制备蒜糖醇的细胞工厂构建及工艺优化

蒜糖醇是一种在食品、医药等领域具有较大应用前景的新型功能性甜味剂。为实现蒜糖醇的绿色生物合成,基于稀有糖转化策略通过共表达葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶及核糖醇脱氢酶,在大肠杆菌体内建立了利用廉价底物D-葡萄糖生产蒜糖醇的多酶级联系统;并通过偶联甲酸脱氢酶构建辅因子循环系统,提高胞内还原型辅酶Ⅰ的再生效率。为平衡多酶级联系统中的个体表达差异,以全细胞催化活性为指标,对细胞工厂的发酵条件和催化条件进行了优化。结果表明:重组菌在20℃、1.00 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的发酵条件下,诱导24 h可得到较佳的蛋白质表达量;在40℃、50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)及5.0 g/L甲酸钠的催化条件下,全细胞可在15 h内转化25.00 g/L的D-葡萄糖生成19.33 g/L蒜糖醇。通过表达系统的优化进一步降低了底物和中间产物的残留量,蒜糖醇的产量提高至21.12 g/L。研究旨在为全细胞生物转化法实现蒜糖醇的规模化合成提供理论依据,探索以预处理甘蔗糖蜜为底物生产蒜糖醇的可行性,希望对延长糖产业链,提高糖产品附加值起到积极作用。

从单酶催化到多酶级联催化--从王义翘教授在酶技术领域的贡献说开去

作为国际生物工程和生物技术领域的奠基人和业界泰斗,麻省理工学院王义翘教授几十年来的研究涵盖了生化工程的上、中、下游的众多方向。在酶技术领域,他在早期就完成了几项标志性的工作,例如鱼蛋白的酶消化、甲醇氧化酶的固定化、无细胞多酶合成、非水相酶催化等。从2005年开始,王教授在十年间通过新加坡-麻省理工联盟(Singapore-MIT Alliance)项目和新加坡国立大学李智教授联合指导了数名博士生,并在酶技术的几个子方向上取得了重要成果,包括:①开发了酶固定化的方法用于构建高活力可回收的磁性纳米生物催化剂;②探索了P450单加氧化酶在水相-离子液体体系中的不对称亚砜化反应;③开发了基于通透全细胞的辅酶NADPH再生系统;④成功开发了模块化的多酶级联催化合成高值手性化合物,显著拓展了多酶级联催化的复杂度。其中,多酶级联催化因其“一锅法”的合成特性,避免额外的单元操作,节省人力、物力的投入和废弃物的产生等特点,近年来已经成为酶技术领域的研究热点。在介绍王教授相关工作之余,本文还总结了多酶级联催化在合成手性化合物和大宗化学品方面的最新进展,讨论了其未来的发展方向,并就其进一步整合合成生物学以及王教授所践行的定量化和工程化的理念进行了展望。

微流控磁载酶级联传感器检测唾液中葡萄糖的研究

唾液中葡萄糖含量与血糖水平密切相关,可通过非侵入式采集、测定实现血糖的持续、准确监控。但唾液中葡萄糖含量极低,干扰组分众多,对分析方法的选择性、灵敏度、样品用量、响应时间等都提出更严苛的要求。本文通过戊二醛交联法在氨基化磁性微球上固定葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP),利用微流控磁载技术将磁性微球富集在微通道中,为GOx/HRP酶级联反应提供限域环境,基于此构建了高灵敏荧光增强的葡萄糖传感器,实现了唾液样品中葡萄糖含量的测定。在最优实验条件下,葡萄糖在0.01~100μmol/L浓度范围内与荧光强度有良好的线性关系,检出限为3.2 nmol/L,加标回收率为95.3%~103.1%,相对标准偏差小于4.5%。本方法样品用量少、响应时间短、选择性高、检出限低、线性范围宽,适用于人体唾液中葡萄糖含量的快速测定。

酶级联反应放大策略用于灵敏检测酸性磷酸酶

构建了一个新型酶级联反应体系用于灵敏检测酸性磷酸酶(ACP)。焦磷酸根离子(PPi)与Fe3+有很强的结合作用,阻碍了具有模拟过氧化物酶活性的普鲁士蓝纳米粒子(PBNPs)的生成。ACP可将底物PPi水解为PO_4^(3-),从而释放出Fe^(3+)。释放的Fe^(3+)与亚铁氰化钾(K_4[Fe(CN)_6])形成PBNPs,PBNPs可以催化过氧化氢(H_2O_2)产生羟基自由基(·OH),进而催化氧化特征底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB),使体系产生明显的颜色变化,同时伴随吸光度的变化。基于上述原理,构建了一种灵敏检测ACP的方法。结果表明,在3~20 U/L的浓度范围内,氧化TMB(oxTMB)的吸光度与ACP浓度呈较好的线性关系,检出限为0.8 U/L。本研究中,通过天然酶的催化反应产生纳米材料模拟酶构建的酶级联催化反应体系具有高效的信号放大作用,有望在生物传感领域发挥重要作用。

氧化还原酶在多酶级联反应中的应用进展

氧化还原酶催化底物的氧化或还原,具有高效性和专一性,在生物催化或有机合成中应用广泛.多酶级联反应具有缩短反应时间、降低成本、减少不稳定中间产物和副产物的积累,提高产率等优点,已成功应用于手性醇、手性胺和手性氨基酸的合成.根据不同的级联策略,对氧化还原酶在多酶级联反应中的应用进展进行了综述.

CRISPR-dCas系统在食品微生物转录调控与多酶级联中的应用及展望

基于成簇规律间隔短回文重复序列(cluste redregularly interspacedshort palindromic repeats,CRISPR)及其关联Cas蛋白构成的CRISPR-Cas系统已经成为一种革命性基因组编辑工具.近年来,由此衍生而来的CRISPR-dCas(核酸酶活性失活Cas蛋白)系统也被开发成多种高效工具应用于微生物研究领域.本文综述了CRISPR-dCas系统在食品微生物领域,尤其是基于dCas9和dCpf1蛋白的CRISPR系统在食品酿造微生物领域(如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum等)中的转录调控以及多酶级联方向的研究进展,为CRISPR-dCas系统在食品微生物中的应用研究提供参考思路.

双酶级联催化L-色氨酸合成靛蓝

靛蓝(indigo)作为一种水溶性非偶氮类着色剂,广泛应用于纺织、食品、制药等工业领域。目前靛蓝主要采用化学法合成,存在环境污染、安全隐患等问题,亟须寻找更安全、更绿色的合成方法。本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)来源的色氨酸酶(tryptophanase,Ec Tna A)和噬甲基菌(Methylophaga aminisulfidivorans)来源的黄素依赖性单加氧酶(flavin-dependent monooxygenase,Ma FMO)构建双酶级联路径,以L-色氨酸为底物合成靛蓝,导入E.coli中获得重组菌株EM-IND01。通过对限速酶Ma FMO进行蛋白质工程改造,获得了有益突变体Ma FMO^(D197E),比酶活和k_(cat)/K_(m)比野生型分别提高了2.36倍和1.34倍;将其引入菌株EM-IND01中获得重组菌株EM-IND02,并进行发酵条件优化,在5 L发酵罐中靛蓝产量为(1288.59±7.50)mg/L,转化率为0.86 mg/mg L-色氨酸,生产强度为26.85 mg/(L·h)。本研究通过蛋白质工程改造,获得Ma FMO活性提高的突变体,为靛蓝的工业化生产奠定了基础。

多酶级联反应催化γ-丁内酯生成1,4-丁二醇

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇的路径,首先通过己内酯水解酶(ChnC)将γ-丁内酯水解为4-羟基丁酸,接着在羧酸还原酶(Car)的作用下,将4-羟基丁酸还原成4-羟基丁醛,随后,利用醇脱氢酶(YqhD)将4-羟基丁醛进一步还原生成1,4-丁二醇;同时通过引入了甲酸脱氢酶(FDH)构建了NADH/NAD+辅酶循环再生系统.最后对底物添加浓度、催化温度、pH和多酶添加比例进行了优化.综合3种酶的最适反应条件优化之后,在30℃、pH 7.0、酶活力添加比例为1:3:2的优化条件下,以5 g/Lγ-丁内酯为底物,1,4-丁二醇产量达到2.41 g/L,摩尔转化率为46.1%,与优化前相比分别提高了375.46%和374.79%.最后,通过底物补加试验,1,4-丁二醇的合成量最高达到6.31 g/L,摩尔转化率最高达到67.3%.本研究基于新设计的1,4-丁二醇多酶级联催化路径,实现了1,4-丁二醇酶法合成,结果有望为酶催化合成1,4-丁二醇及其高附加值衍生的产品提供一种新的思路.(图12表2参41)

多酶级联反应的构建及其在双官能团功能化学品合成中的应用

利用多酶级联催化反应合成精细化学品是近年来生物催化领域的研究热点。通过构建体外多酶级联体系,可以替代传统的化学合成法,实现多种双官能团功能化学品的绿色合成。本文系统介绍了多酶级联催化反应中不同级联方式的特点及其构建策略,总结了级联反应中元件酶常用的筛选方法、NAD(P)H和ATP等辅酶的再生策略及其在多酶级联反应中的应用,并且阐述了多酶级联催化反应体系在6种双官能团功能化学品,包括ω-氨基脂肪酸、烷基内酰胺、α,ω-二元羧酸、α,ω-二胺、α,ω-二醇、ω-氨基醇合成中的应用。

设计改造羧酸还原酶合成医药中间体(S)-2-氨基丁醇

(S)-2-氨基丁醇同时具有羟基及氨基官能团,是多种重要药物分子的关键手性中间体,生物合成(S)-2-氨基丁醇尚缺少有效的酶元件。以塞格尼氏菌(Segniliparus rugosus)来源的羧酸还原酶SrCAR为研究对象,通过对实验室已有SrCAR突变文库进行筛选测试,结合活性位点共进化分析,同时利用组合活性中心饱和突变策略(Combinatorial active-site saturation test,CAST)构建新的突变体文库,经测试最终获得优势突变体XH7(G430V/E533F/A627N)。该突变体催化底物N-Boc-(S)-2-氨基丁酸到醛产物的活性(kcat/Km)较野生型SrCAR提高2.1倍,热熔值(Tm)提升2.3℃。进一步通过引入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)来源的醇脱氢酶PfADH,可还原N-Boc-(S)-2-氨基丁醛到醇产物。XH7和PfADH的双酶共表达体系反应5 h即可将20 mmol/L底物实现几乎完全转化,转化率达到99%,并经脱Boc保护与分离纯化获得终产物(S)-2-氨基丁醇,得率为60%。通过分子动力学模拟解析最优突变体活性及热稳定性提高的分子机制,为SrCAR酶设计改造提供新的研究思路,拓展酶法合成(S)-2氨基丁醇的生物酶工具箱,可为类似高附加值医药中间体的生物合成提供理论和实践指导。

卤代甲基转移酶的发现与应用研究进展

近年来,甲基化反应在有机合成和生物合成领域中逐渐引起重视。通过甲基转移酶(MT)引入甲基基团,可以调控分子的生物活性和物理化学性质,为精准设计目标分子的结构和功能提供了新的途径。卤代甲基转移酶(HMT)是一类特殊的MT,它不仅可以催化产生各种卤代烃,还可以在碘甲烷等廉价非天然甲基供体的存在下实现昂贵辅因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酶促原位再生。通过HMT的分子改造和同系酶的基因挖掘,可以高效地催化合成或再生SAM及其类似物,为甲基及其他烷基的转移提供更简单的路线。本文主要介绍了HMT的最新研究进展及其突破性工作:通过引入HMT-MT双酶级联反应,创建简单通用的SAM循环再生系统,提高了反应的原子经济性;挖掘到来源于硫嘌呤甲基转移酶家族的新酶(TPMT),很好地解决了甲基供体的环保问题;利用定向进化技术获得HMT优势突变体,能成功实现更长链烷基的转移。这些创新研究为高效生物烷基化提供了新策略,为绿色生物制造带来潜在的技术变革。

重要甾体化合物的化学酶法合成研究进展

甾体化合物因其多功能生物活性和理化特性备受生物医药行业的高度重视,被誉为自然界的“生命之钥”。随着植物甾醇代谢途径的不断解析,国内逐渐形成了“植物甾醇原料-甾体药物中间体-甾体药物”的工业合成路线。日益发展的甾药行业需要不断开发新的合成技术推进甾体药物自上而下高效合成。基于生物信息学、合成生物学、代谢工程以及酶工程的快速发展,甾体化合物的合成技术也取得了重大突破。本文对重要甾体化合物的最新合成进展,包括甾体药物中间体的多样化合成、复杂甾体的化学酶法合成和酵母从头合成植物甾醇原料等方面进行了综述,特别强调了近年来P450羟化酶、3-甾酮-Δ^(1)-脱氢酶、还原酶以及酶级联参与的化学酶法在高效简易合成复杂甾体药物中的代表性工作;在此基础上,也从新一代甾药中间体的开发、新型甾体生物催化剂的挖掘、以分枝杆菌为底盘的甾体合成途径的构建等方面对甾体化合物未来的研究机会和挑战进行了展望。

三酶级联催化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种重要的化工原材料和手性医药中间体,为了实现L-ABA的高效生产,本研究在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中分别表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase,TD)、苏云金芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LDH)和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase,FDH),构建体外级联酶催化反应实现L-苏氨酸向L-ABA的转化,体系中TD、LDH和FDH添加最适比例为1∶1∶0.2。为了简化生产工艺,将3种酶在一株菌E. coli 3FT+L中共表达并实现上述配比,在30 L发酵罐中用E. coli 3FT+L全细胞转化12 h,L-ABA的产量为68.5 g/L,底物L-苏氨酸的摩尔转化率达到99.0%。该工艺路线绿色高效,为未来大规模生产L-ABA提供借鉴。