加工食品中花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定的前处理方法探究与改进

目的构建一种可配合花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒实现对于加工食品中花生成分可靠检测的高质量样品前处理方法。方法对9种不同pH的提取缓冲液提取未处理、湿热处理、干热处理花生蛋白效果进行比较分析以确定最优提取缓冲液类型。而后,将吐温-20、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)以单独或组合添加的方式加入上一步获得的最优提取缓冲液中,提取3组花生蛋白,并对提取效果与夹心ELISA试剂盒检测花生蛋白回收率进行比较分析以确定最优添加剂配方。结果最终确定添加0.2%SDS和0.1%吐温-20的碳酸盐缓冲液(50 mmol/L,pH 9.6)为最优提取缓冲液。向碳酸盐缓冲液中加入SDS、吐温-20较好地提升了花生蛋白的提取率和回收率,将湿热处理花生蛋白回收率提高了2倍以上。结论本研究实现了对商业加工食品中花生成分的可靠检测,为推动过敏原信息在食品标签的准确标注提供了技术支撑,也为相关研究提供了参考。

酶联免疫吸附测定与双抗原夹心法检测抗-HIV比较

目前血站检测无偿献血者的抗-HIV(人类免疫缺陷病毒HIVⅠ型和Ⅱ型抗体)一般采用的是间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法,此方法简便快捷,具有较高的灵敏度和特异性,且价格便宜,适用于献血员的筛选.

抗体夹心酶联免疫吸附法测定鸡白细胞介素-2

利用抗鸡白细胞介素-2(ChIL-2)单克隆抗体作包被抗体、生物素标记的抗ChIL-2多克隆抗体作检测抗体建立了一个抗体夹心酶联免疫吸附测定系统.此系统对鸡白细胞介素-2的检测灵敏度为50 pg/mL.两种抗体与鸡干扰素-α和人白细胞介素-2等细胞因子不产生任何非特异性反应.以不同种类的促有丝分裂剂或鸡病毒刺激鸡淋巴细胞,培养液中分泌产生的天然鸡白细胞介素-2的量用此系统检出.在促有丝分裂剂中,植物血凝素(PHA)导致ChIL-2的产生量最高;在病毒方面,传染性法氏囊病毒最能促使ChIL-2的分泌.本研究建立的抗体夹心酶联免疫吸附测定系统为我们以定量方式测定鸡白细胞介素-2提供了一个灵敏度高、特异性好的工具.

酶联免疫荧光法与双抗夹心酶联免疫吸附法测定屋尘螨组分IgG4的比较

目的运用酶联免疫荧光法（UniCAP法）和双抗夹心酶联免疫吸附法（Fooke法）分别测定经特异性免疫治疗（SIT）的患儿血清sIgG4水平,评价两种免疫定量检测方法的相互关系。方法对45例成功进行皮下SIT的患儿血清分别用UniCAP法和Fooke法检测治疗前、治疗6~8个月后、治疗12~14个月后sIgG4水平。结果与治疗前相比较,在治疗6~8个月和治疗12~14个月后,UniCAP法检测45例患儿血清sIgG4水平全部均有不同程度升高,Fooke法在SIT后6~8个月和12~14个月后分别有40和43例患儿sIgG4水平有不同程度升高,但两种方法检测sIgG4结果升高幅度有差异。结论对于sIgG4测定,SIT后,Uni CAP法比Fooke法测定值升高的幅度更明显。

人C-反应蛋白磁微粒化学发光酶免疫测定法的建立

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是炎症以及各种相关疾病如病毒感染、心血管疾病等诊断、治疗和预后的临床检测指标。为了建立一种快速、准确的CRP定量免疫测定方法,将表达纯化的重组CRP作为抗原免疫小鼠,获得了5株稳定分泌抗体的单克隆抗体细胞株,采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)初步鉴定筛选的抗人CRP单克隆抗体,并分别选择mAb 9D6和mAb 9G4作为捕获抗体与检测抗体,建立用于人CRP检测的化学发光酶免疫测定法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),最后通过测定分析临床血清CRP样本,评价CLEIA的性能。结果显示,基于9D6/9G4-AP单克隆抗体对的CLEIA测定范围为0.1767~500μg/L(可扩展至100 mg/L);所建立的CLEIA与医院采用的免疫散射比浊法(R^(2):0.9496,P<0.0001)表现出良好的相关性,且Bland-Altman分析中96.36%(106/110)的点在95%一致性界限范围内显示两种检测方法具有较好的一致性。结果初步表明,建立的分析方法在临床诊断中具有较好的应用前景。

双抗夹心酶联免疫吸附法检测沙门氏菌

沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌,在中国的食物中毒中沙门氏菌引起的病例占第一位。本研究以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌多克隆抗体。以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359作为检测抗体,建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法可以检测A、B、C、D、E等五种典型的沙门氏菌,对沙门氏菌纯培养液的最低检测量为1×104CFU/mL,与其他杂菌不存在交叉反应,具有较好的灵敏性和特异性。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚A

建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法,测得最佳实验条件为包被抗原浓度为13.8 mg/L、抗体稀释为2.4×105倍,生物素化二抗和酶标亲和素的最佳稀释倍数分别为2000倍和500倍.在优化条件下,方法的线性范围0.2～1000 μg/L;最低检出限0.05 μg/L.所建立的方法用于食品和唾液中双酚A含量的测定,样品处理简单,结果满意.

酶联免疫吸附分析双抗夹心法检测临床鼻咽抽吸物中呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起5周岁以下儿童下呼吸道感染的主要病原体.目前常用的试剂盒是美国Diagnostic Hybrids公司研发的7项呼吸道病毒检测试剂盒,但其价格昂贵,且需荧光显微镜辅助诊断,不利于在基层医疗机构中推广,国内尚无上市的快速诊断试剂用于临床检测.为此建立用于RSV抗原检测的早期快速诊断试剂,并以反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测为参比,同时使用酶联免疫吸附分析(ELISA)双抗夹心法和免疫荧光法对112份临床鼻咽抽吸物(NPA)样本进行检测.ELISA双抗夹心法和免疫荧光法的灵敏度分别为79.31%和74.14%,特异度分别为100%和96.30%,Kappa值分别为0.787 1和0.689 5,两者均与RT-PCR检测结果具有高度一致性.此外,将ELISA双抗夹心法与免疫荧光法比较,两者无显著差异(p>0.05).综上,ELISA双抗夹心法操作简便,特异性高,有望代替进口检测试剂盒完成RSV感染的早期快速诊断.

双抗原夹心法与间接酶联免疫吸附试验法检测丙型肝炎病毒抗体的应用效果分析

目的探讨双抗原夹心法与间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测丙型肝炎病毒抗体的应用效果,旨在分析两种检测方法的灵敏度及特异度,为血液筛查提供参考。方法选取2016年3月至2018年3月我县无偿献血者血液标本1200例作为研究对象,其中抗丙型肝炎抗体(抗-HCV)阴性标本1123例,抗-HCV阳性标本77例。采用双抗原夹心法与间接ELISA法分别进行检测,记录检测结果与丙型肝炎病毒核酸符合率,并进行统计学分析。结果77例抗-HCV阳性标本中,双抗原夹心法阳性检出率96.1%(74/77)高于间接ELISA法87.0%(67/77),差异具有统计学意义(P<0.05),双抗原夹心法检测及间接ELISA法分别有3份和10份假阴性样本出现;双抗原夹心法检测准确度、灵敏度、特异度均高于间接ELISA法,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在检测丙型肝炎病毒抗体的方法中,相比于间接ELISA法,双抗原夹心ELISA法的检测结果较为理想,能够有效提高其阳性检出率、准确度、灵敏度及特异度。

双抗夹心法酶联免疫吸附试验影响因素探析

目的探析双抗夹心法酶联免疫吸附试验中牛血清清蛋白封闭,吐温20及浓度,样品与检测抗体的加样方式及孵育温度对酶联免疫吸附试验检测结果的影响。方法双抗夹心法酶联免疫吸附试验检测人白细胞介素(IL)-1Ra细胞因子作为模型,检测封闭条件,吐温20及其不同浓度,样品与检测抗体分开孵育及共同孵育,酶联孵育温度对标准品浓度与OD值关系的影响。结果酶联免疫吸附试验不封闭、洗液吐温浓度为0.05%且孵育温度为37℃的R^2=0.995 7;BSA封闭的R^2=0.981 1;洗液中吐温浓度0.005%时R^2=0.991 5,0.5%时R^2=0.9868;样品和检测抗体一同孵育1h或2h的R^2分别为0.964 5和0.874 2;孵育温度为25℃的R^2=0.996 1。结论BSA封闭步骤对低浓度的样品检测灵敏度不强;样品和检测抗体及酶稀释液中必须含有吐温20且浓度在0.05%条件下最合适;样品和检测抗体共同孵育会影响对高浓度样品的检测;37℃和25℃的孵育温度条件下的酶联免疫吸附试验检测灵敏度没有差异,但25℃孵育可以降低OD值背景。

用酶联免疫吸附法测定畜产品、饲料中β-兴奋剂类药物

本实验采用酶联免疫吸附法测定β-兴奋剂类药物,在添加浓度为0.5μg/L,1.0μg/L的空白尿液中的回收率均在88.6%~110.3%之间;在添加浓度25μg/kg,50μg/kg的空白猪配合饲料中的回收率均在83.1%~106.2%之间;在添加浓度为0.5μg/kg,1.0μg/kg的空白羊肉中的回收率均在73.6%~106.3%之间;在添加浓度为0.5μg/kg,1.5μg/kg的空白牛肉中的回收率在76.5%~106.5%之间。各添加浓度的批内、批间变异系数均小于11%,满足残留检测方法回收率在60%~120%;批内、批间变异系数小于等于20%的要求。结论:用酶联免疫吸附法可对畜产品、饲料中β-兴奋剂类药物残留进行初步筛选,对疑似阳性样品再用仪器方法确认。

脱落酸间接酶联免疫吸附测定法的建立

报道了一种利用兔抗(+)ABA-C_1-BSA 抗血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 建立的(+)ABA 固相抗原(或称间接)酶联免疫吸附测定法。该法的线性测定范围为0.05～12.5ng;本文还研究了(+)ABA 特异抗体及包被抗原的适宜的制备方法;并在植物样品测定中对该法做了一系列的质量控制试验。

酶联免疫吸附(ELISA)法在食品微生物检测中的应用

本文对酶联免疫吸附(ELISA)法的应用原理以及方法进行了详细分析与介绍,并针对这种方法如何被有效应用于食品微生物的检测中进行了论述,从而为有关单位及工作人员在实际工作中提供一定的方法论支撑。在酶标记抗体技术基础上发展起了酶联免疫吸附测定法,它结合了放射免疫测定法与免疫荧光法的技术优点。

双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测相思子毒素

目的建立相思子毒素(abrin)的酶联免疫检测方法,为abrin临床诊断、中毒治疗、法医学鉴定等应用领域提供技术基础和参考依据。方法采用双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法来检测微量abrin。结果该法检测abrin线性范围为0.125～31.25μg/L,线性回归方程为Y=0.52369X+0.51632(r=0.9816,P<0.0001,n=9),检测限为0.125μg/L。不同浓度蓖麻毒素(ricin)、葡萄球菌肠毒素(SEB)对检测结果基本无干扰,表明该法检测abrin具有很好的特异性。该法能用于abrin毒素污染水样、土样、食品、血液等模拟样品的分析,相对标准差为2.35%～4.14%,具有较好的重现性。结论成功建立了夹心BA-ELISA法检测abrin,巧妙地将多克隆抗体的强富集能力、单克隆抗体的特异性以及生物素-亲和素系统的放大作用结合起来,达到了提高检测的灵敏度和特异性的目的,可适用于各种微量abrin样品的分析。

双抗体夹心-酶联免疫吸附法测定家兔血清中短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的浓度及其药动学研究

目的:建立测定家兔血清中短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白(PBAP)浓度的方法,并考察其药动学特征。方法:取家兔随机分为低、高剂量组(短尾蝮蛇毒PBAP,0.4、0.8mg·kg-1)和阴性对照组(生理盐水),每组5只,耳缘静脉单次给予相应药物,给药前及给药后1、5、15、30、60、120、240、480min分别从颈总动脉取血,加入到短尾蝮蛇毒PBAP抗体包被酶标板(浓度为100μg·mL-1)中,以给药前的正常血清作为空白对照,用双抗体夹心-酶联免疫吸附(ELISA)法测定不同时间点血清中短尾蝮蛇毒PBAP的浓度,并用DAS2.0软件计算其药动学参数。结果:短尾蝮蛇毒PBAP检测浓度的线性范围为0.0024～10μg·mL-(1r=0.9703),平均回收率为98.78%,平均板内变异系数为7.96%,平均板间变异系数为10.94%;低、高剂量短尾蝮蛇毒PBAP的主要药动学参数分别为t1/2α(9.553±4.668)、(9.873±1.433)min,t1/2β(201.295±66.060)、(205.798±76.834)min,cmax(0.685±0.160)、(2.333±0.478)mg·L-1,AUC0～∞(27.114±2.781)、(61.625±11.631)mg·min·L-1。结论:ELISA法准确、灵敏、特异性强,可用于短尾蝮蛇毒PBAP在家兔血清中的药动学研究。

牛初乳中免疫球蛋白G双抗夹心ELISA检测方法的建立

将牛免疫球蛋白G（immunoglobulin G,Ig G）作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选获得分泌抗牛Ig G单克隆抗体的细胞株。制备小鼠腹水抗体,进一步纯化获得抗牛Ig G单克隆抗体。建立双抗夹心酶联免疫吸附法检测牛初乳中Ig G质量浓度,该方法在7.8~1 000 ng/m L范围内有良好的线性关系,最低检出限为7.06 ng/m L,批内变异系数为4.52%,批间变异系数为4.94%,回收率为91.85%~102.45%。此法操作简便、准确度高、稳定性好,可用于实际牛初乳样品的快速检测。

双抗体夹心酶联免疫吸附法测定人干扰素α-2b在豚鼠体液中的含量

目的：建立双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）快速测定豚鼠体液中人干扰素α-2b的浓度,为其新制剂的体内研究奠定基础。方法：对双抗体夹心ELISA法用于豚鼠内耳外淋巴液、脑脊液和血清中人干扰素α-2b浓度的测定进行了方法学考察;豚鼠静脉注射人干扰素α-2b后采集各体液,采用该法测定其中药物浓度。结果：该法在31.25-1 000 pg.mL-1内线性关系良好,板内精密度小于7.8%,板间精密度小于11.9%,各体液中的药物回收率为91%-111%。静脉给药后,药物在内耳外淋巴液和脑脊液中的浓度远远低于血清。结论：该法简单、快捷、灵敏,适用于人干扰素α-2b在豚鼠体内的含量测定及药动学研究。

组织因子途径抑制物-2的时间分辨荧光免疫测定方法的建立及评价

目的建立测定血液中组织因子途径抑制物-2（tissue factor pathway-2,TFPI-2）含量的时间分辨荧光免疫测定方法（time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA）。方法以兔抗人TFPI-2多克隆抗体作为固相抗体,单克隆抗体3C8作为第一抗体,原核表达的人TFPI-2作为标准品,Eu3＋标记的羊抗鼠单克隆抗体作为检测抗体,采用双抗体夹心法建立TFPI-2 TRFIA分析系统,并与酶联免疫吸附法（ELISA）进行比较。结果自制TFPI-2 TRFIA试剂标准曲线的线性范围为0.1~50 ng/mL,灵敏度为0.048 ng/mL,批内和批间变异系数均≤8.39%。应用该方法测定56例冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease,CHD）患者及24例正常体检者血浆中的TFPI-2分别为（10.58±7.12）和（8.53±2.32）ng/mL。结论我们建立的TFPI-2 TRFIA分析方法与ELISA相比灵敏度更好,定量检测结果能够敏感准确地反映血液内TFPI-2的浓度变化,特异性和稳定性均符合要求。

中枢神经系统炎症患者脑脊液S-100B蛋白和神经元特异性烯醇化酶含量的测定

为了探讨脑脊液（CSF）S-100B蛋白和神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量对中枢神经系统（CNS）炎症患者脑损伤的评估价值,采用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法对42例单纯疮疹病毒性脑炎（病脑组）、19例化脓性脑膜炎（化脑组）、17例隐球菌性脑膜炎（隐脑组）患者和22例无神经系统疾病、无肿瘤的外科腰麻患者（对照组）CSF中的S-100B蛋白和NSE进行了动态观察。结果显示,3组CNS炎症患者脑脊液S-100B蛋白含量均显著高于对照组（P<0.01）,其中病脑组>化脑组>隐脑组（P<0.01）;脑脊液NSE含量病脑组最高,与化脑组和隐脑组相比差异有著性意义（P<0.05和P<0.01）,隐脑组与对照组差异无显著性意义（P>0.05）;动态检测发现,脑脊液S-100B蛋白和NSE含量随3组CNS炎症患者病情的轻重而发生相应的变化。研究表明,3组CNS炎症患者脑脊液S-100B和NSE含量均有不同程度的增高,且与患者脑损伤的严重程度有关。