固定时间不同的大鼠视网膜血管铺片酶消化技术改进研究

目的探索固定时间不同的大鼠视网膜铺片酶消化方法和消化时间,提高大鼠视网膜铺片质量。方法正常SD大鼠12只,颈椎脱臼法处死后,摘取眼球,随机分3组于4%甲醛溶液中固定2天、3个月及7个月。将固定好的眼球取出,分离视网膜,每例视网膜再随机分为2份,分别行常规胰蛋白酶消化和改进后的蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化。消化完全后制备视网膜血管铺片,HE染色,显微镜下观察各级血管形态,直到获得清晰的血管图像为止。结果固定2天、3个月及7个月的大鼠视网膜常规胰蛋白酶消化法所用时间分别为:3%的胰酶消化液10 h、6%的胰酶消化液22 h、9%的胰酶消化液28 h。蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法所用时间分别为:0. 1%的蛋白酶K消化15min,3%胰蛋白酶消化5 h; 0. 1%的蛋白酶K消化15 min,6%胰蛋白酶消化7 h; 0. 1%的蛋白酶K消化20 min,9%胰蛋白酶消化20 h。固定2天、3个月的视网膜在两种消化方法中,成片效果基本相同,血管网铺片完整,各级血管形态、走向清晰,无断裂,血管内皮细胞形态及细胞核均清晰显示,但联合消化法消化的更为彻底几乎无其他组织残留。固定7个月的视网膜,采用单纯胰蛋白酶消化的,存在血管断裂现象,而采用联合消化法的视网膜血管断裂现象优于前者。结论改进后的蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法,优于常规胰蛋白酶消化法,对长时间固定的视网膜消化稳定性较好。