微量酶联夹心杂交法定量检测hIL-8 mRNA PCR扩增产物

目的:建立一种灵敏度高、特异性强、定量、精确、操作简便的微孔板酶联夹心杂交技术,定量检测人IL-8 mR-NA。方法:针对人IL-8 mRNA逆转录聚合酶链反应产物一条链的不同区域序列设计一对特异探针,其中一条为捕获探针,5′端用活性氨基修饰,与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合,“竖直”地包被在微孔板内;另一条检测探针的3′端标记生物素,和辣根过氧化物酶结合。提取人外周血单个核细胞总RNA,进行RT-PCR扩增IL-8 mRNA,双链DNA产物经热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交,加入检测探针与已杂交的产物结合,经亲和素-辣根过氧化物酶系统检测杂交信号。结果:该法灵敏度为检出16个循环的PCR产物、5×103个PBMCs中的IL-8 mRNA、检测PCR终产物的最高稀释倍数为1∶256阳性;特异性试验非目的扩增片段酶联杂交检测未检出阳性杂交信号;精密度试验CV为5.2%。结论:该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点,适合IL-8 mRNA PCR扩增产物的定量检测。

逆转录-聚合酶链反应-酶联夹心杂交法检测呼吸道合胞病毒及其亚型感染

目的:建立一种呼吸道合胞病毒(RSV)及其亚型核酸检测方法并初步应用于临床,检测浙南地区RSV及其亚型的流行情况。方法:根据RSVG蛋白基因核苷酸序列设计引物和探针,通过逆转录-聚合酶链反应-酶联夹心杂交法(RT-PCR-ELSH)随机检测了浙南地区连续两年冬春季期间202例急性下呼吸道感染的婴幼儿鼻咽部分泌物中RSV及其亚型的病毒核酸;与病毒分离培养、直接免疫荧光法(DFA)、OligoDetect试剂盒比较探讨其临床实用性。结果:202例标本中RSV阳性123例,阳性检出率为60.9%,2002～2003年和2003～2004年冬春季分别为68.2%和52.6%;两个冬春季都以RSVA亚型为主,占78.9%,2002～2003年冬春季A亚型占RSV阳性标本中的76.7%,2003～2004年A亚型占82.0%;RT-PCR-ELSH阳性检出率与其他三种方法的阳性检出率差异无显著性(P>0.05)。结论:RT-PCR-ELSH法用于检测RSV及其亚型,是一种灵敏度高、特异性强,方便、快速的方法,非常适用于临床标本的大批量检测和流行病学调查;RSV是引起浙南地区冬春季婴幼儿急性下呼吸道感染的最主要的病原体,并以A亚型为主。

微板酶联夹心杂交法定量检测人IL-18 mRNA

目的 :建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术 ,定量检测人IL 18mRNA。方法 :针对人IL 18mRNART PCR产物一条链的不同区域序列设计一对特异探针 ,其中一条为捕获探针 ,5’端为氨基修饰 ,可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合 ,“竖直”地包被在微孔板内 ;另一条为检测探针 ,3’端标记生物素。提取人外周血单个核细胞中总RNA ,进行RT PCR扩增IL 18mRNA ,产物热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交 ,再加入检测探针与已杂交的产物结合 ,最后经亲和素 辣根过氧化物酶 (SAV HRP)系统检测杂交信号。结果 :该法检测IL 18mRNART PCR产物的灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳 ,重复性良好 ,且结果数据化。结论 :该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点 ,适合于PCR扩增产物的定量检测。

逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测人IL-6mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录—聚合酶链反应—微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL-6mRNA的方法。方法:从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交,用链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物系统检测杂交信号。结果:该方法检测IL-6mRNA的灵敏度明显高于逆转录—聚合酶链反应—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于细胞因子mRNA的定量检测。

微量酶联夹心杂交法定量检测TNF-α mRNA

目的 :建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微板酶联夹心杂交技术 ,对人单核细胞分泌的TNF -αmRNA进行定量检测。方法 :设计两条特异探针 ,其中一条为捕获探针 ,5’端带有氨基修饰 ,可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合 ,而且是“竖直”地包被在微孔内 ,另一个为检测探针 ,3’端带有生物素标记。提取人单个核细胞总RNA ,RT -PCR后的扩增产物经变性后加入已包被好捕获探针的微孔板中 ,加入检测探针与已杂交的产物结合 ,最后加入亲和素 -辣根过氧化物酶 (avidin -HRP)显色系统催化底物显色 ,4 5 0nm波长下检测吸光度进行定量。结果 :该方法检测TNF -αmRNA的灵敏度 ,明显高于琼脂糖凝胶电泳 ,而且具有良好的重复性 ,等量PCR产物作 10个复孔 ,吸光度的CV值为 7 2 % ,批间的CV值为 9 1%。在本实验中 ,我们首次尝试着用客观的数据来表示正常人中 1× 10 6个PBMCs中TNF -αmRNA的平均表达量 ,发现该表示方法直观明了 ,结果稳定 ,而且简便可行 ,不需要特殊的仪器及昂贵的试剂。结论 :本方法具有高灵敏度、高特异性、精确、简单易操作 ,结果数据化等优点 。

微量酶联夹心杂交法定量检测TNF-αmRNA

目的：建立一支高灵敏度、高特异性、精确、简便的微板酶联夹心杂交技术，对人单核细胞分泌的TNF－αmRNA进行定量检测。方法：设计两条特异探针，其中一条为捕获探针，5’端带有氨基修饰，可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合，而且是“竖直”地包被在微孔内，另一个为检测探针，3'端带有生物素标记。提取人单个核细胞总RNA，RT－PCR后的扩增产物经变性后加入已包被好捕获探针的微孔板中，加入检测探针与已杂交的产物结合，最后加入亲和素一辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)显色系统催化底物显色，450nm波长下检测吸光度进行定量。结论：该方法检测TNF－αmRNA的灵敏度，明显高于琼脂糖凝胶电泳，而且具有良好的重复性，等量PCR产物作10个复孔，吸光度的CV值为7．2％，批间的CV值为9．1％。在本实验中，我们疼守试着用客观的数据来表示正常人中1×10^5个BPMCs中TNF－αmRAN的平均表达量,发现该表示方法直观明了，结果稳定， 而且简便可行，不需要特殊的仪器及昂贵的试剂。结论：本方法具有高灵敏度、高特异性、精确、简单易操作，结果数据化等优点，适合于微量细胞因子mRNA的定量检测。

微反应板酶联夹心杂交定量检测乙型肝炎病毒基因组

目的 建立一种在微量反应板上进行乙型肝炎病毒(HBV) 基因杂交定量分析的技术。方法 利用人工合成的多组寡核苷酸探针与乙型肝炎病毒全基因组在微量DNA 结合板上进行杂交反应,并利用自制的标记放大探针检测杂交信号,信号值以A 值标示,与标准曲线比较后,可求得待测标本中HBV 基因含量。结果 (1) 本方法可直接从血清标本中对HBV 定量,可定量范围为20pg～20ng/ml;(2) 不与人类基因组及其它病毒或细菌基因组非特异杂交;(3) 定量分析全程5 小时左右。结论 微反应板酶联夹心杂交定量技术灵敏度较高、特异性强、操作简便,可用于HBV

微量酶标夹心杂交法定量检测人iNOS-mRNA

目的 :建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术 ,对人iNOS -mRNA进行定量检测。方法 :设计两条特异探针 ,其中一条为捕获探针 ,5’端连接氨基 ,能与微孔板表面的NOS基团共价结合 ,“竖直”地包被在微孔中 ,另一个为检测探针 ,3’端带有生物素标记。用脂多糖 (LPS)刺激人外周血单个核细胞 2 4h后 ,提取巨噬细胞总RNA ,进行RT -PCR扩增 ,PCR产物热变性后加入到已包被捕获探针的微孔板内 ,并加入检测探针进行夹心杂交 ,最后加入亲和素 -辣根过氧化物酶 (AV -HRP)及底物 ,在 4 5 0nm波长检测杂交信号。结果 :该方法检测iNOS -mRNA的灵敏度明显高于RT -PCR -琼脂糖凝胶电泳 ;特异性高 ,RT -PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现 ;精密度良好。结论 :本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化 ,适合于iNOS

微量酶标夹心杂交法定量检测人iNOS-mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术,对人iNOS—mRNA进行定量检测。方法:设计两条特异探针,其中一条为用捕获探针,5’端连接氨基,能与微孔板表面的NOS基团共价结合,"竖直"地包被在微孔中,另一个为检测探针,3’端带有生物素标记。用脂多糖(LPS)刺激人外周血单个核细胞24h后,提取巨噬细胞总RNA,进行RT—PCR扩增,PCR产物热变性后加入到已包被捕获探针的微孔板内,并加入检测探针进行夹心杂交,最后加入链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物,在450nm波长检测杂交信号。结果:该方法检测iNOS—mRNA的灵敏度明显高于RT—PCR—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT—PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于iNOS—mRNA的定量检测。

脂多糖对人单个核细胞白细胞介素-6基因表达的影响

目的 :探讨脂多糖 (LPS)对人单个核细胞表达白细胞介素 6 (IL 6 )mRNA的影响。方法 :抽取人外周静脉血 ,经EDTA抗凝 ,LPS刺激培养 ,分离单个核细胞并提取总RNA ,将总RNA逆转录为cDNA ,然后用IL 6引物进行热启动PCR扩增。扩增产物热变性后与IL 6检测探针、捕获探针进行夹心杂交 ,最后加入亲和素 辣根过氧化物酶及其底物 ,显色检测杂交信号。IL 6引物及探针用PrimerPremier 5 .0软件设计。结果 :LPS可在转录水平上诱导IL 6mRNA表达 ,其作用强度与LPS剂量呈正相关 ;IL 6mRNA表达丰度有时间效应 ,刺激 4h后 ,IL 6mRNA的表达最高。结论 :LPS能显著增强人单个核细胞表达IL 6mRNA。

RT-PCR-ELISA法定量检测人FGF mRNA

目的 :建立一种灵敏、特异、精确的定量检测人成纤维细胞生长因子mRNA(FGFmRNA)的逆转录 聚合酶链反应 酶联免疫吸附分析技术。方法 :设计两条特异探针 ,其序列分别与FGFmRNART PCR产物的一条链的不同区域互补。其中一条为带有氨基修饰的捕获探针 ,可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合 ,另一条为标记生物素的检测探针。提取人外周血单个核细胞总RNA ,进行RT PCR扩增 ,产物热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交 ,最后加入链亲和素 辣根过氧化物酶 (SAV HRP)及底物 ,在 4 5 0nm波长处检测吸光度。结果 :该方法检测FGFmRNA灵敏度高、特异性好 ,与非目的扩增收稿日期 :2 0 0 2 -10 -3 0 ;修回日期 :2 0 0 2 -11-2 0基金项目 :浙江省自然科学基金资助项目 (No.3 975 10 )。作者简介 :陈少波 ( 1965 -) ,男 ,浙江温州人 ,高级工程师。通信作者 :吕建新 (E -mail:jx@mail.wzptt.zj.cn)。产物杂交无阳性信号 ;重复性良好。结论 :本方法具有操作简单、灵敏度高、特异性好的优点 ,适合于FGFmRNA的定量检测。