纳米抗体多聚化测略提升间接竞争性酶联免疫吸附实验检测黄曲霉毒素M_(1)的灵敏度

酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)具有高通量、操作简单、检测结果明显等优点,是一种较为理想的检测食品中真菌污染物的免疫分析技术。然而,传统的ELISA方法具有较大的局限性,比如使用时抗体易受温度影响,容易变性,贮存期短,易受到检测环境中其他物质干扰而造成假阳性或假阴性等。该实验使用实验室前期获得的抗黄曲霉毒素M_(1)(aflatoxin M_(1),AFM_(1))纳米抗体(nanobody-M4,Nb-M4)与C4结合蛋白(recombinant C4 binding protein alpha,C4BPa)C端片段融合形成自组装七聚体融合蛋白(Nb-M4-C4 bpα),并基于该七聚体开发应用于乳制品中AFM_(1)的间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)。在最佳实验参数下,AFM_(1)的IC_(50)为0.038 ng/mL,检测限为0.009 ng/mL,较单体Nb-M4的提高了8.63倍和5.56倍。与AFM_(1)类似物和其他常见真菌毒素的交叉反应可忽略不计,且在加标乳样中获得了良好的回收率和可重复性。此外,将所开发的方法应用于实际样品中AFM_(1)的分析,结果与HPLC的结果具有很好的相关性(R^(2)=0.995)。该研究表明,自组装的七聚化纳米抗体是改善亲和力和信号放大的有效策略,今后可用于灵敏、选择性和快速检测食品中的霉菌毒素和其他小分子污染物。

间接竞争酶联免疫分析用于薏苡仁中杂色曲霉毒素的快速检测研究

杂色曲霉毒素(Sterigmatocystin,ST)是一种主要由杂色曲霉和构巢曲霉等真菌产生的次级代谢产物,其结构与黄曲霉毒素相似,具有潜在的致癌性和毒性,严重危害人类生命健康。研究发现部分中药易ST污染,但目前针对中药中ST的快速检测研究相对较少。通过系统优化样品前处理条件及影响检测灵敏度的关键参数,建立了简便的间接竞争酶联免疫分析法(ic-ELISA),用于消费量较大的药食同源薏苡仁中ST的快速筛查。所建立ic-ELISA的半数抑制浓度(Half-Maximal Inhibitory Concentration,IC 50)为0.11 ng/mL,线性范围为6.25~100μg/kg,加标回收率在79.27%~99.95%之间,相对标准偏差(RSD)<12%。此外,该方法可抗基质干扰,只需利用溶剂标准曲线即可进行定量。用所建立的ic-ELISA对96批薏苡仁样品进行了检测,并用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对阳性样品进行了确证。该ic-ELISA快速、准确、经济,可作为薏苡仁中ST高通量快筛的技术手段,同时为其他中药中ST的快速检测提供参考。

食品中黄曲霉毒素M_(1)的间接竞争酶联免疫法的建立

该文建立一种间接竞争酶联免疫法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)快速测定食品中黄曲霉毒素M_(1)(aflatoxin M_(1),AFM_(1))的分析方法。AFM_(1)标准品用甲醇稀释,AFM_(1)标准品与AFM_(1)全抗原竞争结合AFM_(1)单克隆抗体,利用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)单组分显色液显色后,酶标仪测定吸光度。在优化好的条件下,浓度范围为9.743~2.605×10^(3)pg/mL时具有良好的线性关系,相关系数(determination coefficient,R^(2))为0.9927,检出限IC_(10)为3.84 pg/mL,加标回收率为88.43%~105.75%。该方法适用性好、操作简单、灵敏度高,满足食品中AFM_(1)分析检测的需求。

间接竞争酶联免疫吸附法检测保健食品中糖皮质激素类药物

目的建立间接竞争酶联免疫吸附(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)法用于保健食品中糖皮质激素类药物多残留检测。方法将可的松、地塞米松分别与丁二酸酐衍生制备免疫半抗原,倍他米松衍生制备包被半抗原,采用活泼酯法与载体蛋白偶联制备人工抗原,采用紫外(ultraviolet,UV)吸收光谱鉴定及基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption-tandem time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)测定人工抗原的偶联比。通过动物免疫,制备针对糖皮质激素类药物的兔多克隆抗体,建立保健食品中糖皮质激素类药物多残留检测ic-ELISA法。结果地塞米松丁二酸酐衍生物为免疫半抗原,倍他米松丁二酸酐衍生物为包被半抗原。通过优化实验条件,确定了最佳的包被原质量浓度为1.25μg/m L,以及最佳的抗体稀释倍数为9000倍。在此条件下,本研究建立的ic-ELISA法对11种糖皮质激素类药物的半抑制质量浓度为0.68~40.17 ng/m L,展现了良好的检测灵敏度。使用甲醇超声提取,样品提取液通过标准稀释液稀释500倍消除基质效应,11种目标分析物在4种剂型保健食品中的添加回收率为81.2%~118.7%,变异系数低于14.00%。结论本研究成功制备糖皮质激素类药物的广谱性多克隆抗体,并建立了保健食品中糖皮质激素类药物多残留检测ic-ELISA法,可用于保健食品中糖皮质激素类药物的快速筛查。

莫米松糠酸酯高特异性抗体制备及酶联免疫分析方法

莫米松糠酸酯(mometasone furoate,MF)是一种常见的糖皮质激素。为快速、便捷地监控MF的滥用情况,制备了MF单克隆抗体并建立了其竞争酶联免疫检测方法。将氨氧乙酸分别连接至MF和莫米松二糠酸酯(mometasone difuroate,MDF),合成了免疫半抗原和包被半抗原。免疫半抗原以活泼脂法连接钥孔血蓝蛋白获得全抗原,通过免疫小鼠、细胞融合及筛选获得能够稳定分泌抗MF单克隆抗体的细胞株,制备并纯化了抗体。该抗体的主要识别区域为MF的五元环区域,因此不和常见的64种糖皮质激素发生交叉反应。建立了基于异源包被的MF间接竞争酶联免疫检测法,其半抑制浓度(IC_(50))为1.2 ng/mL,对肌肉和肝脏的最低检出限分别为0.52μg/kg和0.59μg/kg。灵敏度相比于同源包被提升了20倍。使用60%甲醇水溶液提取动物组织的添加回收率为70%~82%。该方法能有效应用于动物组织中MF的快速筛查。

基于免疫磁珠净化间接竞争酶联免疫吸附试验检测氟喹诺酮类药物

本研究旨在建立一种基于免疫磁珠进行分离、富集和净化前处理,检测鸡肉、鸡肝和鱼肉中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争酶免疫吸附试验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)的研究方法。通过对合成免疫磁珠及免疫磁珠净化过程中单克隆抗体添加量、偶联时间、缓冲液pH、抗原添加量、抗原捕获时间、温度及包被条件等进行优化,初步建立了基于免疫磁珠净化的icELISA检测方法。结果显示:1)在1 mg的磁珠中,沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)单克隆抗体最佳偶联量为15μg,偶联时间60 min,pH为4.4;2)最佳抗原添加量为1 ng·mL^(-1),捕获时间40 min,缓冲液为0.01 mol·L^(-1)PBS,IC50为0.73 ng·mL^(-1),线性范围为1.0~3.2 ng·mL^(-1);3)氟喹诺酮类药物在鸡肉、鸡肝、鱼肉的检测限均不超过1.33、2.17、2.31μg·kg^(-1),回收率为76.83%~98.70%,批内变异系数批间变异系数均不超过15%,经验证,鸡肉样本检测结果与高效液相色谱法(HPLC)结果一致。结果表明,与传统仪器检测方法相比,该方法提高了检测氟喹诺酮类药物的简便性、选择性以及检测效率,为氟喹诺酮类药物的残留检测提供了新思路。

集成化酶联免疫微流控平台检测红酒中的赭曲霉毒素A

目的基于微流控芯片在自动化、检测成本上的优势,建立高效的间接竞争酶联免疫吸附法检测红酒中的赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的方法。方法设计按压阀控制的微流控芯片,将含有OTA的样本以及其余4种免疫检测试剂注射进入芯片中。通过负压泵驱动这些试剂分别流经包被有OTA的硅膜夹层进行检测。确定抗原和抗体的工作浓度,绘制拟合标准曲线,计算检出限,分析真实样本的加标回收率。结果抗原为鸡蛋卵白蛋白(ovalbumin,OVA)偶联的OTA,孵育质量浓度为5.0μg/mL,捕获抗体为鼠抗OTA抗体,工作质量浓度为5.0μg/mL,检测抗体为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG),稀释倍数为1:1000,OTA的线性范围为1~32 ng/mL,检出限为0.632 ng/mL,干红葡萄酒中的回收率为94.48%~105.76%;相对标准偏差为6.54%~11.18%。结论建立的方法检测成本低,灵敏度高,准确性好,可用于红酒中OTA的定量检测,为检测食品中的生物标志物提供参考。

基于酶联免疫分析方法检测畜禽饲料中恩拉霉素

本文建立了一种应用于检测畜禽饲料中恩拉霉素的间接竞争酶联免疫分析法。采用羰基二咪唑法将生物活性高的恩拉霉素A组分合成的半抗原偶联卵清蛋白,构建检测原;同时将杂交瘤细胞株2H1F91免疫BALB/c小鼠,制备特异性识别恩拉霉素的单克隆抗体。在此基础上,构建了恩拉霉素的间接竞争酶联免疫分析法的标准曲线,该曲线IC_(50)为91.61ng/mL,线性范围为25.73~471.39ng/mL,检出限为13.11ng/mL。猪饲料样品的添加回收率为91.60%~95.75%,鸡饲料的添加回收率为89.33%~94.80%,并且二者的变异系数均低于12%,这表明建立的方法结果可靠,适用于畜禽饲料中恩拉霉素含量的快速检测。

基于QuEChERS样品前处理的间接竞争酶联免疫分析法快速检测薏苡仁中黄曲霉毒素B_(1)

目的解决间接竞争酶联免疫分析法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)检测薏苡仁中黄曲霉毒素B_(1)(Aflatoxin B_(1),AFB_(1))的基质干扰问题,建立一种简便的高通量检测方法,用于薏苡仁中AFB_(1)的快速筛查。方法以ic-ELISA的显色值和抑制率为评价指标优化样品前处理过程,重点考察QuEChERS萃取净化技术、不同稀释溶剂和稀释方式消除基质效应的效果,并对建立的方法进行方法学考察,最后应用于薏苡仁实际样品检测,检测结果用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进行确证。结果建立了一种无需任何校正,可用溶剂标准曲线进行定量分析的ic-ELISA。方法的半数抑制浓度为0.074 ng/mL,线性范围为1.37~20.0μg/kg,加标回收率在75.12%~84.46%之间,RSD小于6%。122批薏苡仁及其相关样品中AFB_(1)的阳性率为20.5%,阳性样品的超标率为24.0%,污染水平为1.76~27.56μg/kg。ic-ELISA与LC-MS/MS检测结果的相关系数(r)为0.98。结论QuEChERS萃取净化技术能够有效去除薏苡仁中的干扰成分,对快速样品前处理方法的建立具有重要应用价值,结合本研究所建立的ic-ELISA,为薏苡仁中AFB_(1)的检测和监测提供简便有效的技术手段。

间接竞争酶联免疫分析法快速检测决明子中黄曲霉毒素B_(1)的研究

目的:建立适用于中药决明子中黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))快速检测的间接竞争酶联免疫分析法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)。方法:首先采用棋盘滴定法优化抗原抗体最佳浓度,建立抑制曲线,然后以显色值和灵敏度为评价指标筛选样品的提取和稀释方法。对所建立的方法进行方法学考察,最后用于实际样品检测。结果:经过优化,确定样品的最佳提取溶剂为乙腈-甲醇溶液(90∶10,v/v),稀释溶液为甲醇-PBS溶液(10∶90,v/v),稀释倍数为20倍。方法的半数抑制浓度为0.078 ng/mL,线性范围为0.016~0.25 ng/mL,回收率为85.00%~109.2%,RSD为0.45%~9.08%。采用所建立的方法对25批决明子进行了检测,经液相色谱-串联质谱法确证,超过限量标准的样品的假阳性率小于5%。结论:本文所建立的ic-ELISA灵敏、简便,适用于决明子中AFB_(1)的快速筛查,但仍存在一定的假阳性率,后续还需要对产生干扰的基质因素进行研究并消除,进一步提高检测的准确度。

基于酶联适体竞争法检测谷物制品中真菌毒素的研究

核酸适体作为一种新型分子识别元件,具有可体外合成、易修饰、稳定性好等优势,被认为是抗体的良好替代物。自玉米赤霉烯酮(ZEA)核酸适体被成功筛选以来,基于核酸适体与靶标的高特异性结合,构建了酶联适体间接竞争法检测玉米赤霉烯酮的新方法。ZEA与ZEA适体互补链DNA1竞争性结合酶标板上固定的ZEA适体,未结合的DNA1链被DNA2链捕获并标记辣根过氧化物酶,通过酶联显色反应实现对ZEA的可视化检测。优化了包被亲和素的质量浓度、封闭液、适体及互补链浓度等关键参数,并考察了酶联适体竞争法检测ZEA的灵敏度、特异性和实用性。结果表明:在0.5~100 ng/m L范围内,ZEA的质量浓度与反应体系的吸光度呈良好的线性关系(R2=0.995 9),检出限为0.44 ng/m L。该方法的特异性良好,对玉米和玉米油的检测与酶联免疫试剂盒测定的结果一致,具有简便、经济和高灵敏度的特点。

直接竞争酶联免疫法检测大麦中玉米赤霉烯酮

建立一种大麦中玉米赤霉烯酮的快速检测方法。采用酶联免疫吸附法(ELISA)对玉米赤霉烯酮进行测定。该方法的最低检出限(IC15)约为0.01μg/kg,灵敏度(IC15)约为0.08μg/kg,大麦样品加标回收率在73.3%～96.7%之间,最低检出限为4μg/kg。此方法特异性强,灵敏度高,样品处理过程较为简单,适用于大量样品的快速检测。

直接竞争酶联免疫法测定食品中的丙烯酰胺含量

丙烯酰胺由于分子量小、结构简单,制备其特异性抗体难以实现。本研究将丙烯酰胺与对巯基苯乙酸衍生合成半抗原,偶联载体蛋白并免疫动物制备针对丙烯酰胺衍生物的特异性抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,进而建立通过检测丙烯酰胺衍生物实现对丙烯酰胺定量分析的直接竞争酶联免疫分析方法。本方法对丙烯酰胺的检出限为3.0μg/L,线性范围为9.2~195μg/L,对饼干、薯片及咖啡样品中丙烯酰胺的平均添加回收率为83.6%~112.7%,结果与标准检测方法 HPLC-MS/MS符合。本方法可用于食品样品中丙烯酰胺的快速检测。

间接竞争酶联免疫分析方法检测花生中黄曲霉毒素B1

目的:针对花生中强毒性污染物黄曲霉毒素B1(AFB1)建立了一种准确、灵敏的间接竞争酶联免疫分析方法(ic-ELISA)。方法:制备了AFB1包被抗原,包被量为0.1μg/孔;抗体稀释64000倍;选用0.1%脱脂乳粉为方法封闭液,0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)为样品稀释液;结果:在最优的试验条件下,建立的ic-ELISA对目标物AFB1的检测线性范围为0.0097~0.088μg/L(R2=0.999);灵敏度(IC50)和检出限(IC15)分别达到0.027μg/L和0.0066μg/L。板内变异系数(n=6)为0.29%~16.9%,板间变异系数(n=6)为0.22%~21.19%。在花生样品中AFB1的检测灵敏度(IC50)为1.04μg/kg,回收率为96.67%~106.51%。结论:本研究建立的ic-ELISA方法操作相对简便,检测灵敏度高、准确性好,可稳定地用于花生样品中AFB1污染物的定量分析检测。

雌二醇间接竞争酶联免疫吸附方法的建立

建立食品中雌二醇免疫分析方法。将雌二醇进行结构改造合成半抗原并经过核磁氢谱和红外光谱验证,再采用活泼酯法与载体BSA和OVA偶联制备人工抗原,免疫兔子制备多克隆抗体,经过反应条件优化建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法。结果表明:IC50为3.9ng/mL,检测限为0.3ng/mL,交叉反应率均小于1.21%。检测方法具有高灵敏度和特异性,可应用于食品中雌二醇检测试剂盒的研制。

检测T-2毒素的直接竞争性酶联免疫吸附测定法的研究

目的 本研究在自制T-2毒素酶标半抗原的基础上，结合市售抗T-2毒素单克隆抗体，建立了检测谷物中T-2毒素的直接竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）。方法粮食样品经70％甲醇-水溶液提取，用滤纸过滤并稀释后。再用0．45μm滤器过滤净化，该滤液用于ELISA检测。结果本方法最低检出量为0．125ng／ml，添加70-280ng／g T-2毒素的大米样品和面粉样品的平均回收率分别为85～117．5％和98．1～102．5％。结论结果表明，该方法简化了粮样提取步骤。可用于谷物及加工产品中T-2毒素的检测。

直接竞争酶联免疫吸附-高效液相色谱法测定烯效唑

应用本实验室制备的对烯效唑具特异性亲和力的多克降抗体,采用包被抗体直接竞争模式建立烯效唑的酶联免疫吸附分析法。在优化条件下,对烯效唑标样检测的线性范围为1～10^(-4)mg/L,线性中浓度为1.31μg/L,5次重复测定的相对标准偏差(RSD)为8.4%;检出限为0.022μg/L。在苹果中分别添加烯效唑标样1 0,0.1和0 01 mg/kg;直接竞争E LISA法测定的回收率分别为84.6%～101.0%,99.6%～117 0%和80.8%～92.8%;RSD(n=5)分别为8.6%,6.9%和6.7%。ELISA法对苹果中烯效唑的检出限为0.024μg/kg。在同样前处理条件下,高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UVD)法对苹果中烯效唑的检出限为0.25 mg/kg,苹果中添加1 00 mg/kg烯效唑,HPLC UVD法测定的回收率为92.6%。

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定桃中氰戊菊酯的残留量

采用包被抗体、酶标半抗原直接竞争酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定了氰戊菊酯在桃中的残留量。结果表明：在氰戊菊酯多克隆抗体包被浓度为4．0mg／L、辣根过氧化物酶（HRP）标记氰戊菊酯半抗原稀释1．0×10^5倍条件下，ELISA法检测氰戊菊酯的线性浓度范围为0．01-10mg／L，氰戊菊酯对抗体．酶标半抗原反应的抑制中浓度（IC50）为193μg／L，相对标准偏差（RSD，n=5）为4．5％，IC20为13．5μg／L。在2、0．2和0．05mg／kg添加水平下，ELISA法测定桃中氰戊菊酯的回收率分别为81％-89％、85％～98％和85％-106％，RSD（n=5）分别为5．1％、5．6％和7．7％。ELISA法对桃中氰戊菊酯的最低检出浓度为0．014mg／kg。

间接竞争酶联免疫吸附法检测蜂王浆中链霉素

目的:基于定量检测蜂王浆中链霉素的残留量,建立快速检测蜂王浆中链霉素的间接竞争酶联免疫吸附方法。方法:采用制备链霉素人工抗原、筛选杂交瘤细胞、利用体内诱生腹水法制备抗链霉素单克隆抗体。结果:Logit/Log拟合标准曲线为y=-2.1x+0.8,相关系数r=0.9943,线性检测范围为4～324μg/kg,半数抑制浓度(IC50)为79μg/kg,检测限为4μg/kg,灵敏度为0.1μg/kg,蜂王浆样品的检测值符合率大于90%;采用方法二的样品前处理方法,链霉素阴性样品的添加回收率为67.7%～86.7%,样品重复检测结果的变异系数为4.3%～5.6%。结论:建立的间接竞争酶联免疫吸附法具有较好的特异性、检测符合率、回收率和重复稳定性,可用于蜂王浆中链霉素残留的检测。

生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤

目的将生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法（BA-c ELISA）引入甲氨蝶呤血药浓度检测,建立一种快速、简便、敏感、特异的甲氨蝶呤检测方法。方法将NH2活性生物素与MTX单抗Ig G化学连接,采用亲和素-HRP酶标记系统,建立放大竞争酶联免疫吸附法,连续制备5批试剂盒,对试剂盒进行批内批间精密度、敏感性、特异性、准确性和稳定性进行验证,检测口服MTX的类风湿关节炎患者血清MTX浓度,并对其检测结果进行判定。结果建立的生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤的方法具有很好的敏感性和特异性,检测MTX的灵敏度达到0.087 ng/m L,检测下限为0.137 ng/m L,检测线性范围为0.1~10 ng/m L;批内RSD为3.3%~8.7%,平均批内差异为6.5%,批间RSD为7.6%~9.9%,重复性教好,检测回收率为94.2%~112.8%。结论生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法检测MTX,操作简单,具有较好的灵敏度和特异性。