检测猪链球菌2型的溶菌酶释放蛋白(MRP)的PCR方法的建立

根据猪链球菌 2型的mrp基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 885bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测溶菌酶释放蛋白 (MRP)的PCR方法。用XbaⅠ内切酶进行酶切 ,获得了与预期一致的 5 78bp和 30 7bp的 2个片段。并进行了PCR的特异性试验和敏感性试验。对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎支原体的PCR检测结果均呈阴性 ;检测的敏感度可达 10 0个细菌。另外 ,对 9株从病猪体内分离的猪链球菌 2型菌株进行了检测 ,8株呈阳性 ;对 15份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果是 1份为阳性。结果表明此法特异性和敏感性均很高 ,可作为MRP快速诊断和流行病学调查的手段。

猪链球菌2型人源分离株截短的溶菌酶释放蛋白基因的克隆及原核表达

目的:克隆及表达猪链球菌2型(S.suis2)人源分离株Habb截短溶菌酶释放蛋白(MRP)基因。方法:根据S.suis2mrp基因的序列设计引物,克隆和分析江苏海安患者分离株Habb截短mrp基因(tmrp),构建原核表达质粒pGEX4T-2-mrp。在大肠杆菌中诱导带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的融合蛋白tMRP-GST表达;经亲和层析法纯化后,用凝血酶酶切去除重组蛋白中的GST,制备纯化的截短MRP(tMRP)抗原。用Westernblot检测重组抗原的活性。结果:序列分析表明,获得的tmrp基因长957bp;原核表达的融合蛋白tMRP-GST的相对分子质量(Mr)约61000;凝血酶处理的tMRP抗原的Mr约为35000。Westernblot分析显示,MRP-GST、tMRP蛋白均可与MRP多克隆抗血清发生特异性反应。结论:成功地克隆人源分离株Habb截短的mrp基因,并在原核系统实现高效表达,制备的纯化抗原tMRP具有良好的抗原性,为开展相关免疫学研究奠定了基础。

微量乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞活性的几个主要影响因素

对乳酸脱氢酶释放法测定小鼠脾脏 NK细胞活性中的酶促反应时间、效靶细胞比例、检测波长、细胞毒试验孵育时间、维持液中小牛血清 ( FCS)浓度等 5个重要的影响因素进行了探索。结果显示 ,酶促反应时间以 1 0 min最佳 ;效靶细胞比例以 1 5∶ 1为适宜 ;最适检测波长为 570 nm,其结果线性关系好 ;细胞毒试验孵育时间以 2 h为宜 ;维持液中小牛血清以低浓度为宜 ,其结果更接近自然杀伤百分率计算公式 ,并选用 2

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合和凋亡

猪链球菌 2型 (SS2 )溶菌酶释放蛋白 (MRP)的致病作用迄今不明 ,为此 ,以HEp 2细胞为上皮细胞体外模型 ,将纯化的MRP溶液和细胞共孵育 ,光镜观察 ,发现MRP可诱导细胞发生两种典型形态学变化 :一是诱导细胞融合形成多核巨细胞 ,随后巨细胞发生凋亡 ;二是诱导单个细胞凋亡。透射电镜观察和流式细胞分析确证MRP具有诱导上皮细胞凋亡的功能 ,凋亡率达 1 8%。证明MRP可单独作为SS2的毒力因子。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导血管内皮细胞融合

猪链球菌2型(SS2)主要引起人和猪的脑膜炎,但其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)对构成血脑屏障的微血管内皮细胞有何致病作用迄今不明。为此分离仔兔脾微血管内皮细胞(SMEC),纯化后用SV40-T 抗原转化后用作试验的细胞模型。将单层SMEC 和电泳纯MRP 溶液共孵育,染色后,光镜观察,发现MRP 可诱导SMEC发生两种典型形态学变化:致密细胞单层中出现巨大空洞而呈网状;空洞内有细胞融合,形成多核巨细胞,随后巨细胞核极度浓缩释出,巨细胞消失。研究结果表明, MRP 单独足以破坏大脑的血管内皮细胞屏障。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白功能性片段的原核表达及其免疫保护性

目的表达猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)的功能性片段(tmrp),并检测其对小鼠的免疫保护性。方法将构建的重组克隆载体pMD-tmrp经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将切下的目的基因tmrp亚克隆至原核表达载体pGEX-3X中,转化E.coliBL21(DE3),鉴定正确后,用IPTG诱导,谷胱甘肽亲和层析纯化GST-tmrp,免疫BALB/c小鼠,测定其免疫保护率。结果阳性工程菌经IPTG诱导,表达了可溶性目的蛋白,相对分子质量约为73000。0.8mmol/LIPTG,37℃,pH7.2诱导4h,表达量最高,为25.36%。经亲和层析纯化,融合蛋白纯度达93.7%。免疫BALB/c小鼠后,免疫保护率可达60%。结论已成功获得了具有免疫活性的GST-tmrp。

猪链球菌2型溶菌酶释放因子MRP在重组沙门菌中的表达

从猪链球菌2型(SS2)四川分离株分离溶菌酶释放因子基因mrp,将其克隆至T载体上,再将asd基因插入到重组质粒的抗生素抗性基因中,电击转入asd缺陷型沙门菌X4072中表达,形成依赖asd基因的质粒-宿主平衡致死系统。经酶切、PCR及蛋白电泳鉴定,证实重组菌株能够稳定表达MRP,从而为SS2的防制提供了可能候选疫苗株。

粘红酵母胞内L-苯丙氨酸解氨酶释放的研究

分别考察了液氮冷冻法、超声破碎法、甘氨酸与丙氨酸化学渗透法,不同化学渗透剂TritonX-100、Tween80、Span20、溴代十六烷基吡啶,有机溶剂甲苯、脲及EDTA对粘红酵母(Rhodotorula glutinis)胞内苯丙氨酸解氨酶(即PAL酶)释放及活力的影响,比较发现超声破碎与TritonX-100联用酶释放效果显著,先加入10%Triton X-100渗透6h,再在800W超声破碎30min,蛋白释放率达76.7%,总酶活70.3%,为提取胞内PAL酶提供了一种新方法。

乳酸脱氢酶释放法检测鸡自然杀伤细胞活性条件的优化

以肉仔鸡外周血自然杀伤(NK)细胞作为研究对象,探讨乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞活性中5个最为关键的影响因素,选用Yac-1淋巴瘤细胞作靶细胞.结果表明:效靶细胞比为15∶1,在含2%犊牛血清的RPMI 1640维持液中,效靶细胞于37℃、5%CO2条件下作用2 h,于37℃恒温条件下酶促反应10 min,检测波长为492 nm可获得满意结果;验证试验结果表明,优化的LDH释放法检测鸡外周血NK细胞活性的方法是可行的.

酶释放法用于细胞介导的细胞毒试验问题分析

目的 :检验分析酶释放法用于细胞毒试验存在的问题。方法 :用51Cr释放法和MTT比色法、NAG比色法 ,单独或相互比较 ,检验分析细胞毒试验中效靶细胞相互作用规律 ,酶在细胞代谢中分布情况 ,细胞死伤前后酶释放特点。结果 :以MTT为底物的酶在细胞代谢中主要分布在细胞膜表面 ,而以NAG为底物的酶分布在细胞内。细胞有自主释放酶的功能 ,正常细胞与受损伤细胞释放酶速度不同。细胞毒作用过程中效应细胞也有损伤 ,也有酶释放 ,与靶细胞死伤后释放的酶属于同一类 ,而且混合在一起 ,目前尚无可行的定量分离和鉴别方法。酶释放法用于细胞毒试验 ,对于不同状态的标本检验结果没有规律性 ,不能反映机体免疫功能状态。结论 :酶释放法不宜用于细胞介导的细胞毒试验。

溶菌酶释放蛋白介导猪链球菌2型的血凝活性

比较了猪链球菌 2型 (SS2 )MRP+ 菌株HA980 1和MRP-菌株 0 0 64 44的血凝特性及溶菌酶释放蛋白 (MRP)在血凝过程中的作用。 2株菌均能凝集人A、B、O型及猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠、绵羊、山羊、水牛的红细胞 ,不凝集鸡、鲫鱼、鲤鱼、金鱼的红细胞 ,且对人、猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠红细胞的凝集价极显著高于绵羊、山羊和水牛 (P <0 .0 1) ;MRP+ 菌株对人、猪、兔、BALB/c小鼠和豚鼠红细胞的凝集价均极显著高于MRP-株 (P <0 .0 1)。MRP+ 株的血凝活性对热处理极其敏感 ,且凝集速度和反应温度呈负相关。半乳糖、胰酶预处理MRP+ 株菌体能完全阻断其血凝 ,葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、过氧化氢、巯基乙醇对其则无明显影响。用纯化的MRP处理红细胞、抗MRP兔血清和MRP的单克隆抗体处理菌体 ,均能显著降低MRP+ 菌株的凝集价 (P <0 .0 5 ) ,但不能完全抑制 ;用抗MRP-菌株兔血清处理菌体 ,也能显著降低MRP+ 株凝集价。试验证明 :MRP是SS2的黏附素 ,具有半乳糖特异性受体 。

鱼精蛋白对人结肠肥大细胞IgE依赖性与非依赖性类胰蛋白酶释放的调节

目的 :探讨鱼精蛋白对人结肠肥大细胞IgE依赖性与非依赖性类胰蛋白酶释放的调节。方法 :人结肠组织经酶消化后 ,细胞成分用全HBSS重新悬浮。激发过程在LP4 试管中、 37°C条件下完成。用酶联免疫吸附试验方法测定类胰蛋白酶水平。结果 :促分泌剂抗IgE抗体和离子载体钙 (CI)均可明显刺激人结肠肥大细胞类胰蛋白酶的释放。鱼精蛋白浓度在<10 μg mL时可以剂量依赖性的方式抑制抗IgE抗体和CI诱导的类胰蛋白酶释放 ,但是 ,浓度为 10 0 μg mL时 ,作用则相反。在 37°C条件下同结肠细胞预培养 2 0min ,1μg mL的鱼精蛋白可明显抑制抗IgE抗体和CI诱导的类胰蛋白酶释放 ,而 10 μg mL的鱼精蛋白则起相反的作用。结论 :小剂量鱼精蛋白可以抑制肥大细胞IgE依赖性与非依赖性类胰蛋白酶的释放 。

含猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因片段的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)基因片段的重组腺病毒并对其进行鉴定。方法根据MRP的基因序列,设计合成1对引物,以SS2型基因组为模板,扩增MRP基因片段(467-1351)序列。将PCR产物通过pMD18-T载体克隆后,再连接至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MRP,再经PmeⅠ酶切,然后转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞中,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-MRP。PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒质粒,再转染AD-293细胞进行病毒包装,最后对细胞包装的病毒液进行PCR和Western blot法鉴定。结果重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-MRP转染AD-293细胞8 d后出现明显的细胞病变,在培养细胞的上清病毒液中也检测到了MRP基因片段及其表达的蛋白。结论成功构建了SS2型MRP基因片段的重组腺病毒(rAdeno-MRP)。

前列腺癌激肽释放酶3 mRNA表达与前列腺癌病理特征的相关性

目的:探究前列腺癌激肽释放酶3(klk3)mRNA表达与前列腺癌病理特征的相关性。方法:选取39例前列腺增生患者(良性组)、57例无家族遗传史的前列腺癌患者(非家族遗传组)、29例家族遗传性前列腺癌患者(家族遗传组)为研究对象。分析klk3 mRNA表达与前列腺癌临床病理特征的关系。结果:家族遗传组外周血klk3 mRNA水平高于非家族遗传组、良性组(P<0.05)。外周血klk3 mRNA水平诊断家族性前列腺癌的曲线下面积(AUC)为0.843,灵敏度为62.07%,特异度为96.49%。Logistic回归显示,外周血klk3 mRNA水平为家族性前列腺癌发生的危险因素(P<0.05)。Gleason评分8~10分患者的外周血klk3 mRNA水平高于Gleason评分7分、6分患者,肿瘤分期Ⅲ~Ⅳ期患者的外周血klk3 mRNA水平高于Ⅰ~Ⅱ期患者,Psa水平>20 ng/mL患者的外周血klk3 mRNA水平高于Psa水平10~20 ng/mL及<10 ng/mL患者(P<0.05)。结论:klk3基因mRNA表达对家族遗传性前列腺癌具有诊断价值,且与Gleason评分、肿瘤分期等病理特征有关。

组织激肽释放酶家族在病原微生物感染中的作用

组织激肽释放酶(tissue kallikrein-related peptidase, KLK)家族是丝氨酸蛋白酶家族中一种具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶性质的蛋白水解酶亚群,有15个家族蛋白,分别为KLK1~KLK15。近年来,越来越多的研究表明,KLK家族可通过切割病毒和细菌关键蛋白、激活多种宿主受体、调控激肽系统等方式参与机体的多种生理活动,影响着病毒、细菌和真菌中多种病原微生物感染的进程,作用机制复杂且广泛。本文通过对近年来KLK家族蛋白在微生物感染中的作用和机制进行综述,以更好地探究KLK在微生物感染中的重要作用,特别是为其在结核分枝杆菌感染中的研究提供思路,也为KLK家族蛋白作为抗结核治疗靶点提供理论基础。

特异性T细胞体外释放酶联免疫法检测结核病的临床应用

目的:探究特异性T细胞体外释放酶联免疫法检测结核病的临床应用价值。方法:选取疑似发生结核病患者128例进行临床研究,患者均在医护人员辅助下完成结核菌素皮肤试验、特异性T细胞体外释放酶联免疫法、结核分枝杆菌分离培养检验,以结核分枝杆菌分离培养结果为金标准,统计前两种方法的诊断结果与诊断效能。结果:结核分枝杆菌分离培养结果如下,阳性、阴性检出率分别是62.50%与37.50%。结核菌素皮肤试验、特异性T细胞体外释放酶联免疫法的阳性率、阴性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。特异性T细胞体外释放酶联免疫法的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值大于结核菌素皮肤试验(P<0.05)。结论:结核病临床诊断中应用特异性T细胞体外释放酶联免疫法,诊断效能较好,值得临床推广。

难治性癫痫儿童血浆激肽释放酶、组织蛋白酶B的表达及其临床意义

目的:探讨难治性癫痫儿童血浆激肽释放酶(KLK)、组织蛋白酶B(catB)表达及其临床意义.方法:选取2017年3月至2019年3月河南中医药大学第五临床医学院收治的难治性癫痫患儿43例为研究对象,纳入研究组.选择同期在本院治疗的治疗有效癫痫患儿,同期在本院体检的健康儿童作为对照,分别纳入治疗有效组(n=35)及对照组(n=50).①对3组受试儿血浆KLK、catB,白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平分别进行统计学分析.②分析研究组患儿血浆KLK、catB水平,分别与其血浆IL-8、IL-6、TNF-α水平的相关关系.③受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC),对难治性癫痫的诊断截断值、诊断灵敏度及特异度.④采取多因素非条件Logistic回归分析难治性癫痫临床诊断的独立影响因素.结果:①研究组患儿血浆KLK、catB、IL-6、IL-8、TNF-α水平,均显著高于对照组、治疗有效组,并且差异均有统计学意义(P<0.05).②研究组患儿血浆KLK、catB水平与其IL-6、IL-8、TNF-α水平,均呈正相关关系(r=0.625、0.628、0.657,0.634、0.619、0.664,P<0.05).③血浆KLK、catB水平ROC曲线的AUC分别为0.889、0.856,对难治性癫痫的诊断截断值分别为3.99 U/mL、3.66 U/mL,二者单独诊断难治性癫痫的灵敏度分别为72.10%、72.10%,特异度分别为92.00%、94.00%;二者联合诊断的AUC为0.950,灵敏度为86.00%,特异度为90.70%.④血浆KLK高表达(OR=2.652,95%CI:1.668~4.218,P<0.05),以及catB高表达(OR=2.635,95%CI:1.704~4.075,P<0.05),均是导致患儿发生难治性癫痫的独立危险因素.结论:难治性癫痫儿童血浆KLK、catB水平高表达,对难治性癫痫患儿的临床诊断具有重要参考价值.

降压宝蓝片对SHR肾损害及激肽释放酶-激肽系统的影响

目的探讨降压宝蓝片对自发性高血压大鼠(SHR)肾损害及激肽释放酶-激肽系统(KKS)的影响。方法30只12周龄雄性SHR随机分为模型(SHR)组(0.5%羧甲基纤维素钠)、依那普利组(0.02 g/kg依那普利)、降压宝蓝片组(0.6 g/kg降压宝蓝片),另设同龄正常血压的雄性WKY大鼠为对照(WKY)组(0.5%羧甲基纤维素钠),灌胃给药,连续12 w。取肾组织,苏木素-伊红(HE)及马松三色(Masson)染色观察肾小球硬化指数(GSI)及肾组织间质胶原蛋白容积分数(CVF)变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肾组织匀浆液低分子量激肽原(LK)、组织激肽释放酶(TK)、缓激肽(BK)、前列环素(PG)I2;Western印迹测定肾组织缓激肽2型受体(B2R)蛋白表达。结果与WKY组比较,SHR组GSI和CVF显著增加(P<0.01),肾组织BK、PGI2含量及B2R蛋白表达显著降低(P<0.05)。降压宝蓝片能显著降低SHR大鼠GSI、CVF(P<0.01),明显升高肾组织PGI2含量及B2R蛋白表达(P<0.05),对BK、TK、LK含量有升高的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论降压宝蓝片对SHR有肾保护作用,部分作用机制与激活KKS活性有关。