假单胞菌ND6菌株水杨酸羟化酶基因(nahG)的核苷酸序列分析和酶鉴定

水杨酸羟化酶是细菌萘降解途径中的关键酶,它能催化水杨酸脱羟和羟化,生成儿茶酚.假单胞菌(Pseudomonas)DN6菌株的萘降解基因位于102kb的质粒pND6-1上,以pUC18质粒为载体,制备了含有1～3kbpND6-1DNA随机片段的基因文库,通过DNA测序和DNA序列同源性分析,从基因文库中筛选出含有水杨酸羟化酶基因nahG的克隆.nahG基因的大小为1305bp,编码的水杨酸羟化酶(NahG)由434个氨基酸组成,与PseudomonasputidaNCIB9816-4菌株的水杨酸羟化酶基因相比,核苷酸序列的同源性为100%,与其它10种细菌的水杨酸羟化酶基因相比,核苷酸序列的同源性为32%～99%.酶学实验表明,ND6菌株的水杨酸羟化酶具有广泛的底物特异性,它不仅能代谢水杨酸,还能代谢多种水杨酸的衍生物,如乙酰水杨酸、黄基水杨酸、3-甲基水杨酸、5-甲基水杨酸和5-氯水杨酸等.

基因编辑与诊断工具酶LwCas13a的克隆表达、纯化与酶活性鉴定

目的开发可大量制备具有天然酶活性的基因编辑与诊断工具酶LwCas13a的技术,为研究基因编辑或开发基因诊断试剂提供稳定的酶。方法以LwCas13a蛋白基因序列为模板,采用PCR技术扩增目的基因LwCas13a,运用NotⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将酶切产物与相同酶切获得的载体pC013用T4 DNA连接酶连接构建成含有融合表达His标签的原核表达载体pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a,选择经酶切和测序鉴定均正确的质粒转化到E.coli BL21感受态细胞中,用0.5 mmol·L^(-1)的异丙基-β-D-硫代丰乳糖苷在16℃条件下诱导16 h,表达LwCas13a酶,产物经SDS-PAGE电泳检测,获得可溶性表达条件后,进行大量蛋白诱导表达,使用Ni^(2+)亲和层析法,纯化LwCas13a蛋白。利用LwCas13a酶的“侧向切割活性”检测纯化获得的酶。结果PCR扩增获得3479 bp序列完全正确的LwCas13a基因,重组蛋白以融合蛋白形式可溶性高效表达,纯度达到98%。经比较优于商业化的LwCas13a酶。结论成功获得具有天然侧向剪切活性的LwCas13a酶,为开发使用LwCas13a酶的分子诊断试剂提供原材料奠定了基础。

多星韭黄酮醇合成酶基因AwFLS1的克隆及功能验证

黄酮醇合成酶(Flavonol synthase,FLS)可以催化3种二氢黄酮醇形成相对应的黄酮醇,是调控黄酮醇合成的关键酶。以多星韭(Allium wallichii)盛开期花朵为材料,提取RNA并通过反转录获得cDNA,利用PCR技术对AwFLS1基因进行克隆并完成生物信息学分析;利用qRT-PCR技术分析AwFLS1基因在多星韭花朵不同发育时期、不同组织器官的表达,初步推测其功能;构建原核表达载体BL21-pET32a(+)-AwFLS1,制备可溶性重组蛋白并进行体外酶活性鉴定。结果表明,多星韭AwFLS1基因CDS全长为1008 bp,编码335个氨基酸,推测形成一种不稳定且不定位于膜上的非分泌亲水性蛋白,分子量约为38.22 kDa,具有保守的2-酮戊二酸/FeⅡ依赖型双加氧酶结构域。AwFLS1基因在多星韭花朵不同发育时期表达量呈逐渐降低趋势,在小苞期最高;在不同组织器官中,表达量存在显著差异,在叶中表达量最高,根中表达量最低。AwFLS1重组蛋白可在体外催化3种二氢黄酮醇底物形成对应的黄酮醇,底物偏好性有待进一步验证。研究结果证实了多星韭AwFLS1在类黄酮代谢途径中的功能,为解析多星韭黄酮醇合成机制奠定了理论基础,为利用基因工程技术提高药用植物活性成分含量提供了候选的基因资源。

薰衣草醇酰基转移酶基因(AAT)的克隆和表达分析

醇酰基转移酶(AAT)可以催化乙酰辅酶A与萜烯醇类物质的结合,生成各类乙酸酯类化合物。为探明薰衣草AAT基因在酯类化合物合成中的调控作用,本研究以薰衣草品系杂花叶片为供试材料,利用反转录PCR技术克隆薰衣草AAT基因的cDNA序列,该cDNA序列长度为1344 bp,其编码蛋白质由447个氨基酸组成,是非跨膜亲水性蛋白质,属于PLN02481超级家族;薰衣草AAT与黄色猴面花EgAAT亲缘关系最近,相似度为60.87%。AAT基因在苞叶中的表达量最低,在花瓣中的表达量最高;在花冠不同发育时期,该基因在盛开期表达量到达峰值。构建原核表达载体pET-28a-AAT,筛选了重组蛋白在大肠杆菌Transetta(DE3)中的最适诱导表达条件,诱导后获得的重组蛋白质相对分子质量为5.026×10^(4),重组蛋白以包涵体形式存在,具有将芳樟醇催化合成乙酸芳樟酯的生物活性。本研究结果为进一步验证薰衣草AAT基因在酯类化合物合成过程中的功能提供了基础。

蜈蚣等5种动物类中药18SrRNA基因酶切鉴定的初步研究

目的 用基因酶切法鉴定蜈蚣等 5种动物类中药 ,为中药生物鉴定法的构建提供基本方法。方法 PCR法 (聚合酶链式反应 )与酶切。结果 限制性内切酶EcoRⅡ可以一次性鉴别出 5种动物中药。结论 EcoRⅡ是鉴定蜈蚣等 5种动物药1 8SrRNA基因最佳内切酶 ,酶切的基本步骤为 :基因片段的扩增、酶切、电泳检测 ,该方法可用于中药的品种鉴定 。

用酯酶同工酶酶谱鉴定病原菌专化型研究

用酯酶同工酶酶谱对尖孢镰刀菌 (Fusariumoxysporum)专化型、丝核菌 (Rhizoctoniaspp .)融合群和炭疽菌 (Colletotrichumspp .)的部分种进行了鉴定 ,并获得成功 。

农杆菌质粒DNA的间接酶切鉴定

采用常规手段提酶切鉴定法,与普通大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒提取农杆菌质粒酶切鉴定法(简称试剂盒法)和农杆菌质粒反导大肠杆菌间接酶切鉴定法(简称间接法)进行对比,发现本试验创新的试剂盒法和间接法可轻松做酶切鉴定,可为农杆菌质粒DNA提取经验不足者参考。

β-甘露聚糖酶产生菌的分离、鉴定及产β-甘露聚糖酶最适条件的研究

以采集的土壤样品为试验材料，经过富集培养及分离纯化，筛选出2株产β-甘露聚糖酶的菌株。采用摇瓶培养分别测定其酶活力，其中1株菌株酶活力较高，酶活力达50．36U／ml。生理生化性质鉴定及16SrDNA序列相似性结果表明该菌为假单孢菌（Pseudomonas sp．）。产酶的最适条件研究发现，1g／100ml玉米粉，2g／100ml魔芋粉，pH6．0，32℃为最优产酶条件，酶活力达185．37U／ml，是优化前的3．68倍。该茵产酶迅速，培养12h后已达产酶高峰。粗酶的性质研究发现，该酶是一种酸性的甘露聚糖酶，作用的最适pH为4．0，最适反应温度为55℃；该酶的稳定性较好，在pH4．0～6．0、温度为40—55℃保持较好的稳定性。

灰色链霉菌RX-17溶菌酶R2的纯化及其酶学鉴定

从灰色链霉菌 (Streptomycesgriseus)RX 1 7的发酵液中 ,通过硫酸铵分级沉淀 ,CM SephadexC 5 0和CM SepharoseFastFlow离子交换层析 ,纯化得到了溶菌酶R2 .该酶分子量约为 2 4 8kD ,等电点约为 9 7,N端 1 5个氨基酸的顺序为DTSGVQGIDVSHWQG .R2酶溶解变链球菌Ingbritt(StreptococcusmutansIngbritt)的最适作用温度为 5 5℃ ,最适pH为 7 0 .5 0℃处理 1h ,R2酶残存酶活74 % ,碱性条件 (pH >9)下该酶保持稳定 .Zn2 + 、Cu2 + 、Fe2 + 、Cd2 + 、Pb2 + 可使酶完全失活 ,螯合剂、盐酸羟胺、溴替丁二酰亚胺及离子型去垢剂SDS抑制R2酶的溶菌作用 ,而非离子型去垢剂TritonX 1 0 0等则能促进溶菌 .R2酶溶菌谱广泛 ,能够溶解多种鸡卵清溶菌酶不能作用的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 .从对金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)的高活性来看 ,该酶应分类为 β 1 ,4 N ,6 O 二乙酰胞壁质酶 (β 1 ,4 N ,6 O diacetylmuramidase) .

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其活性的鉴定

商品化的乙醛脱氢酶主要从动物细胞、肝细胞线粒体中提取,其来源受到很大的限制,而且价格昂贵。为了解决乙醛脱氢酶原料有限的问题,利用微生物发酵法获取乙醛脱氢酶。将人乙醛脱氢酶2基因(aldh2)克隆至原核表达载体p ET32a中,构建重组载体p ET32a-ALDH2。将构建的重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白得到大量表达;且对诱导表达条件进行优化。结果显示,在37℃,1.0 mmol/L IPTG诱导表达6 h为最优表达条件。由于目的蛋白几乎都是以包涵体形式表达,为了得到有活性的乙醛脱氢酶,对包涵体变性、复性和纯化进行了研究。试验数据显示,酶的最终得率为14.49 U/L。并通过用Bradford法,测定复性蛋白的浓度约为77μg/m L,进行活性检测表明,该复性蛋白具有乙醛脱氢酶活性,酶活性约为1.449 U/m L。通过构建重组载体p ET32a-ALDH2和优化表达条件,aldh2在原核表达宿主E.coli BL21(DE3)得到大量表达;此外,利用透析复性法得到的复性蛋白酶活性有所提高。

Klebsiella sp.B-36的分离鉴定及产脂肪酶特性研究

从郑州西郊采集的土壤样品中筛选到一株产耐高温酸性脂肪酶菌株B-36,根据其形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析初步鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)。对该菌株产脂肪酶特性研究结果表明:该酶的适宜作用温度为60℃,适宜pH 4.0,该酶在60℃热处理70 min酶活力可保持在80%以上,说明该酶具有良好的热稳定性。同时,该酶在酸性环境中静置1 h后还保持70%以上的酶活力,说明该酶在酸性条件下较稳定。金属离子Mg2+、Ca2+、Na+以及EDTA对酶有明显的激活作用,Fe3+、Cu2+及Zn2+对酶有抑制作用,K+对酶几乎没有影响。

高活性Co^2＋-替代海因酶中Co^2＋的定量及酶学活性鉴定

利用产D-海因酶(HDT)的重组pE-hdt/E.coli菌株,在LB培养基中添加40μmol/L的Co2+,37℃培养10h,表达产物经Q-Sepharose阴离子交换剂和Phenyl-Sepharose疏水层析,获得电泳纯Co2+-D-海因酶(Co2+-HDT).该酶对底物DL-海因的比活性较HDT高约6倍,达21.8U/mg.可见光光谱分析表明,在498nm和568nm处呈现Co2+-海因酶络合物的特征性吸收峰.用ICP-AES测定纯酶金属离子含量,HDT每摩尔亚基含0.93摩尔Zn2+和0.04摩尔Co2+,而Co2+-HDT中每摩尔亚基中含0.17摩尔Zn2+和0.89摩尔Co2+.这一结果表明,HDT中的Zn2+已被Co2+所替代.此外,在动力学常数,pH和温度稳定性,金属螯合剂EDTA的影响等方面,HDT和Co2+-HDT也略有差异.

东山湾软珊瑚共附生可培养细菌的多样性和产酶活性鉴定

利用稀释10倍的2216E培养基,采用涂布平板法分离软珊瑚共附生可培养细菌,然后提取各菌株基因组DNA,扩增其16S rRNA基因并测序,通过比对分析确定菌株的分类地位,进而研究东山湾软珊瑚共附生可培养细菌的多样性;同时测定各菌株产淀粉酶、蛋白酶和酯酶能力,进而获得具有产酶活性的细菌资源.结果表明:一共分离到244株细菌,剔除重复后共获得128株不同的细菌.128株细菌包括变形菌纲(86株)、放线菌纲(高G+C革兰氏阳性菌,17株)、厚壁菌门(低G+C革兰氏阳性菌,22株)和拟杆菌纲(3株)4大类群,共包含44个属,72个种,多样性十分丰富,其中有9株细菌的16S rRNA基因相似度低于98.0%,为分离到的潜在新种.同时,128株细菌3种酶活检测的结果表明:16株细菌具有淀粉酶活性,73株细菌具有酯酶活性,23株细菌具有蛋白酶活性,其中15株细菌同时具有3种酶活性.本研究首次报道了东山湾软珊瑚共附生可培养细菌丰富的多样性,同时获得了具有良好的产酶特性菌株资源,具有进一步研究和应用价值.

2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶重组蛋白的制备及鉴定

目的链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphotase,STP)是重要的磷酸化信号调控系统成员之一。文中对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)STP编码基因stp进行原核表达并对纯化蛋白进行酶活测定。方法对S.suis 2 stp进行生物信息学分析,PCR扩增stp基因片段,构建重组表达载体pET28a::stp。将载体转入E.coli BL21中,经IPTG诱导,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)为底物测定其水解量进而鉴定磷酸酶活性。结果从05ZYH33基因组中PCR扩增到810 bp的片段,经连接获得重组表达载体pET28a::stp;经诱导表达及纯化获得相对分子质量为32000的重组蛋白,该蛋白在Mn2+存在下能够水解pNpp。结论获得纯度较高的STP重组蛋白,该蛋白具有Mn2+依赖的磷酸酶活性,为后续阐明STK/STP磷酸化系统的调控机制打下基础。

南大西洋热液区沉积物可培养细菌的多样性分析和产酶活性鉴定

为获得深海可培养微生物资源,利用2216E培养基,采用涂布平板法从南大西洋热液区沉积物中分离可培养细菌,并通过16S rRNA基因进行分类鉴定.同时测定各菌株产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、褐藻酸酶和脂肪酶(三丁酸甘油酯和吐温80)的能力.分离共获得216株菌株,经16S rRNA基因序列比对,共获得71株不同的菌株.其中包括变形菌纲62株、放线菌纲3株、芽孢杆菌纲2株和拟杆菌纲4株,分布于27个属,41个种.酶活检测结果显示,具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶(底物为三丁酸甘油酯)和脂肪酶(底物为吐温80)的产酶细菌分别为18、14、25、32株,供测细菌中未检出产果胶酶、木聚糖酶和褐藻酸酶的菌株.这些菌株为进一步研究开发提供了深海微生物资源.

甜菜NADH-NR gDNA全长序列的克隆及酶切鉴定

为了研究甜菜NADH-NR gDNA的序列特征,从分子水平上为甜菜硝酸盐累积差异机理的研究做铺垫;利用二倍体甜菜品种‘甜研7号’,采用分步克隆方法,分别获得甜菜NADH-NR基因组DNA的3’端序列和5’端序列以及中间序列,再以3’端和5’端序列设计特异引物,克隆获得甜菜NADH-NR基因组DNA的全序列;结果表明,甜菜NADH-NR gDNA全长序列6346bp,经与先前获得的甜菜NADH-NR cDNA序列比对,甜菜NADH-NR gDNA含有3个内含子,4个外显子。内含子大小分别为197、1088、2343bp。甜菜NADH-NR gDNA的外显子序列与菠菜的同源性达到78%,但内含子序列在进化期间发生了较大分化,甜菜NADH-NR gDNA的内含子相对菠菜要大,两者也不处于同样的位点,甜菜NADH-NR gDNA的内含子靠近5'端较早出现,每个内含子大小均是菠菜的1.10～1.71倍。本研究首次从甜菜中克隆获得NADH-NR gDNA全长序列,揭示了其序列特征并将其与其他作物进行了比较分析,为进一步利用该基因开展甜菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。

荧光酶免疫分析仪-微生物鉴定仪在水产品沙门氏菌检测中的应用

采用全自动荧光酶免疫分析仪进行初筛,全自动微生物鉴定仪进行阳性菌株的生化性状鉴定,建立了水产品沙门氏菌的快速检测方法。经过48h增菌之后,VIDAS法可在45min之内出具结果,阳性菌株经选择性培养基分离及纯化后根据VITEK检测结果判定是否属于沙门氏菌。联用法的灵敏度为菌悬液浓度≥103cfu/mL,一般染菌样品经48h增菌之后菌悬液浓度均能达到106cfu/mL以上。采用联用法与国标法对参考菌株和124种水产品进行检测,结果完全一致。联用法快捷、有效,适用于水产品沙门氏菌的检测。

鼠源巨噬细胞RAW264.7中TNF-α基因的克隆及酶切鉴定

TNF-α能诱导单核巨噬细胞系统的前体细胞分化,是机体非特异性免疫检测中指示性细胞因子。本研究根据Genbank NM-013693上登录的小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)序列对经过氨基多糖纳米微粒处理过的小鼠RAW264.7细胞进行RNA的提取,且RT-PCR扩增TNF-α基因。将此片段克隆到PUCm-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定、酶切鉴定分析验证,证实所克隆序列为TNF-α基因。序列分析表明,该基因与Genbank中发表序列的同源性达到100%。

一株高产琼胶酶海洋细菌的筛选与鉴定

从广东省南澳岛采集龙须菜(Gracilaria lemaneiformis),分离海洋来源的琼胶酶产生菌,并对其进行分类鉴定,为琼胶酶的开发利用奠定基础。利用4种不同的筛选培养基分离产琼胶酶的菌株,通过形态、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定并构建系统发育树,通过DNS法测定琼胶酶活力,研究菌株所产琼胶酶的类型,对菌株的生长曲线及发酵产酶曲线进行初步测定。结果显示,分离得到一株高产琼胶酶的菌株ZQM2017,该菌株为革兰氏阴性短杆菌,16S rRNA基因序列分析显示该菌株属于弧菌属(Vibrio sp.),结合形态特征和生理生化实验结果鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus);可同时产α-琼胶酶与β-琼胶酶;该菌株在液体培养基中28℃,180 r/min振荡培养时,其对数期出现在3-9 h,发酵5 h即有明显产酶,当发酵至46 h,所产琼胶酶活力达到最高109.87 U/mL发酵液。从南澳岛龙须菜上自主分离筛选得到的海洋细菌ZQM2017,经鉴定命名为Vibrio alginolyticus ZQM2017,可同时分泌α-琼胶酶和β-琼胶酶,所产琼胶酶初始活力高达109.87 U/mL。

质粒提取与酶切鉴定实验教学感悟

生物化学与分子生物学实验教学涉及多种重要的分子生物学技术,对于临床医学和临床医学类专业学生的科研和工作具有重要意义。本文以质粒提取与酶切鉴定为主,就教学过程中发现的问题展开分析,探讨如何达到更好的教学效果、培养学生的科研思维。